王亞欣，張志文，任怡琳，劉 敏，史勁松，許正宏，許泓瑜*

1江南大學(xué)藥學(xué)院；2江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；4青藏高原微生物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，拉薩 850000

2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病率日漸增加，胰島β細(xì)胞功能受損和胰島素抵抗是其兩大發(fā)病機(jī)制[1]。過(guò)去認(rèn)為胰島素抵抗在T2DM病理生理機(jī)制中占主要位置,現(xiàn)在越來(lái)越多地認(rèn)識(shí)到胰島β細(xì)胞功能障在T2DM發(fā)生發(fā)展中起重要作用。胰島β細(xì)胞功能障礙是T2DM發(fā)生的必要條件,胰島β細(xì)胞凋亡是造成胰島素分泌能力絕對(duì)下降的重要因素[2]。

滇結(jié)香Edgeworthiagardneri(Wall.)Meissn，E.gardneri屬于瑞香科、結(jié)香屬植物，主要分布在我國(guó)西藏及云南地區(qū)。滇結(jié)香是我國(guó)特有的珍貴藥材，據(jù)《藏醫(yī)養(yǎng)身圖說(shuō)》書中記載，滇結(jié)香花具有清肝明目等作用，民間泡水飲用對(duì)糖尿病、高血壓、高血脂等慢性疾病均具有預(yù)防和治療效果[3]，其主要成分包括雙香豆素類、黃酮類、多酚類等[4]。隨著人們對(duì)滇結(jié)香研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗菌[5]、抗氧化[6]、降血糖[7]、降血脂[8]等多種作用。

本實(shí)驗(yàn)室前期在2型糖尿病動(dòng)物模型上評(píng)價(jià)滇結(jié)香提取物，發(fā)現(xiàn)滇結(jié)香花水提取物具有良好的降糖活性，能增加胰島素分泌量，并對(duì)損傷胰島組織有一定的修復(fù)作用[9]。因此利用胰島損傷模型對(duì)滇結(jié)香花提取物中保護(hù)胰島的物質(zhì)進(jìn)行篩選并探究其降糖作用機(jī)制是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)從滇結(jié)香花中提取分離制備組分，通過(guò)胰島細(xì)胞損傷模型及化學(xué)誘導(dǎo)型T2DM小鼠模型對(duì)其體外、體內(nèi)降糖活性和作用機(jī)制進(jìn)行研究，為滇結(jié)香花保護(hù)胰島細(xì)胞治療T2DM提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，體重16～20 g，30只。購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。

1.2 細(xì)胞株

大鼠胰島β細(xì)胞RIN-m5F，購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)。

1.3 藥物與試劑

滇結(jié)香花由西藏月王公司提供，與保藏在中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所的滇結(jié)香標(biāo)本一致，并經(jīng)分子鑒定確認(rèn)；RPMI-1640 培養(yǎng)基和無(wú)糖RPMI-1640 培養(yǎng)基胎牛血清(GIBCO公司，美國(guó))；噻唑藍(lán)(MTT)、胰酶(碧云天公司)；AKT、FOXO1、JNK抗體(CST公司，美國(guó))；棕櫚酸(PA)、葡萄糖、DCFH-DA(Sigma公司，美國(guó))；鏈脲佐菌素(STZ)(麥克林公司)；艾塞那肽注射液(Baxter Pharmaceutical Solutions LLC公司，美國(guó))；其他試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 主要儀器

Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(Thermo-Labsysytems公司，美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司，美國(guó))；倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)；蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司美國(guó))；冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))；PCR擴(kuò)增儀、熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國(guó))。

2 方法

2.1 滇結(jié)香花提取物的制備

取干燥滇結(jié)香花(500 g)粉碎后，按質(zhì)量體積比1∶10正己烷提取，于60 ℃浸提6 h，過(guò)程中不斷攪拌。過(guò)濾得澄清濾液，濾渣再重復(fù)浸提兩次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷后得到滇結(jié)香花正己烷提取物(EGH)。

2.2 劑量與分組

將3周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠分為空白對(duì)照組(NC)與造模組，NC組喂養(yǎng)普通飼料，造模組喂養(yǎng)60%高脂飼料4周后，連續(xù)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(50 mg/kg/day)5天，注射結(jié)束后監(jiān)測(cè)FBG 2周，待血糖穩(wěn)定升高且FBG ≥ 11.1 mmol/L時(shí)造模成功，然后隨機(jī)分成模型組、陽(yáng)性對(duì)照組以及低中高EGH干預(yù)組?？瞻讓?duì)照組(NC)：灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；模型組(DM)：灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；陽(yáng)性對(duì)照組(EX)：腹腔注射艾塞那肽4μg/kg/day；EGH低劑量組(L-40 mg/kg/day)；EGH中劑量組(M-80 mg/kg/day)；EGH高劑量組(H-160 mg/kg/day)。

2.3 空腹血糖(FBG)

每周定時(shí)檢測(cè)小鼠FBG。小鼠測(cè)量FBG前一晚8點(diǎn)開(kāi)始禁食12 h，自由飲水，第二天早8點(diǎn)剪尾采血測(cè)量FBG。

2.4 全血中糖化血紅蛋白(HbAlc)的檢測(cè)

采用南京建成全血中糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)HbAlc，遵照試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)定。

2.5 空腹血清胰島素

采用賽默飛小鼠胰島素酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胰島素水平。遵照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并用酶標(biāo)儀測(cè)量結(jié)果，計(jì)算胰島素濃度。

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及胰島損傷細(xì)胞模型建立

在37 ℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，采用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的1640培養(yǎng)基(含有10 mmol/L萄糖，不含胰島素)培養(yǎng)RIN-m5F細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)采用胰酶消化，按1∶3比例傳代，每2～3天傳代一次。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RIN-m5F細(xì)胞，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中。根據(jù)安麗萍等[10]和藺憶[11]等方法加以改良，采用0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基刺激RIN-m5F細(xì)胞6 h作為誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷的條件。

2.7 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

將RIN-m5F細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，加入刺激藥物孵育，一定時(shí)間后進(jìn)行MTT測(cè)定。孵育結(jié)束后,棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞后，將細(xì)胞與MTT(0.5 mg/mL)一起孵育4 h，棄去培養(yǎng)基并加入DMSO(150 μL)，避光震蕩10 min，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD，重復(fù)3次)。

2.8 DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平

將RIN-m5F細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔黑色熒光板中，實(shí)驗(yàn)分為6 組：正常組(CTL)：含1640完全培養(yǎng)基；模型組(DM)：0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組(EX)：0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基加入10 nM艾塞那肽；實(shí)驗(yàn)組：0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基加入50 μg/mL(L)、100 μg/mL(M)、200 μg/mL(H)滇結(jié)香花正己烷提取物。作用細(xì)胞時(shí)間為6 h。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用10μM DCFH-DA探針于37 ℃孵育細(xì)胞30 min。使用激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/525 nm的酶標(biāo)儀分析其熒光強(qiáng)度。以空白組的熒光強(qiáng)度(0 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合10 mmol/L葡萄糖)為100%，對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行相對(duì)定量。

2.9 熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)

采用苯酚抽提法提取細(xì)胞總RNA,按照條件(25 ℃,10 min;48 ℃,40 min;95 ℃,5 min;4 ℃保存)反轉(zhuǎn)錄為cDNA.然后按照條件(50 ℃,2 min;95 ℃,10 min,一個(gè)循環(huán);95 ℃,15 s;60 ℃,1 min,40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增)進(jìn)行qRT-PCR.以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法對(duì)caspase-3基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量,計(jì)算其表達(dá)倍數(shù),所需引物序列如下：

表1 qRT-PCR引物序列

2.10 蛋白免疫印跡

將RIN-m5F細(xì)胞接種到6孔板(1.5×106個(gè)細(xì)胞/孔)上。處理后，用冰的裂解緩沖液裂解RIN-m5F細(xì)胞。根據(jù)蛋白質(zhì)含量試劑盒說(shuō)明測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。在10%聚丙烯酰胺凝膠上分離等量蛋白質(zhì)的樣品，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，分別用針對(duì)AKT，F(xiàn)OXO1，JNK的選擇性抗磷酸化或非磷酸化抗體進(jìn)行檢測(cè)。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用于平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性差異表示為：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均在GraphPad Prism 5中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 EGH對(duì)胰島損傷模型小鼠空腹血糖(FBG)的影響

空腹血糖作為糖尿病的常用檢測(cè)指標(biāo)，其變化可初步反映藥物的降糖活性。如表1，STZ誘導(dǎo)C57BL/6J糖尿病模型小鼠的FBG與正常組相比，具有顯著性升高的差異，且四周后并無(wú)恢復(fù)；陽(yáng)性藥物EX和EGH低、中、高三個(gè)劑量治療一周后FBG開(kāi)始降低，持續(xù)治療四周后，EX降低FBG 57.02%，低、中、高三個(gè)劑量分別降低FBG 22.91%、32.18 %、40.04%，結(jié)果顯示EGH可有效降低胰島損傷糖尿病模型小鼠的FBG。

3.2 EGH對(duì)胰島損傷模型小鼠糖化血紅蛋白(HbAlc)的影響

表2 EGH對(duì)C57BL/6J T2DM小鼠模型FBG的影響(n=5)

注：與正常組相比，***P< 0.001；與模型組相比，##P<0.01，###P< 0.001。

Note:Compared with control group,***P<0.001;compared with model group,##P<0.01,###P<0.001.

HbAlc主要表示過(guò)去4～8周內(nèi)平均血糖控制水平，如圖1所示，C57小鼠HbA1c含量DM組顯著高于NC組(**P<0.01)；治療4周后EX組HbA1c含量顯著降低(##P< 0.01)，且接近于NC組；EGH治療可明顯減少C57BL/T2DM模型小鼠HbA1c含量，并呈劑量依賴性，其中高劑量組效果與陽(yáng)性藥物艾塞那肽相近。

圖1 EGH對(duì)C57BL/6J小鼠HbAlc的影響Fig.1 Effect of EGH on HbA1c of T2DM model C57BL/6J mice注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。Note:Compared with control group,**P<0.01;compared with model group, ##P<0.01.

3.3 EGH對(duì)胰島損傷模型小鼠胰島素分泌的影響

胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一的降血糖激素，也是唯一能同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素，血清胰島素的測(cè)定是糖尿病診斷的必要參考指標(biāo)[12]。結(jié)束治療后，收集小鼠空腹時(shí)的血清，采用ELISA檢測(cè)小鼠的血清胰島素水平，如圖2，糖尿病模型小鼠的血清胰島素水平明顯低于正常小鼠(***P<0.001)；治療四周后，治療組較模型組小鼠的血清胰島素水平顯著上升(#P<0.05,##P<0.01,)；中、高劑量的EGH可明顯提高糖尿病小鼠的血清胰島素水平。

圖2 EGH對(duì)T2DM模型小鼠胰島素分泌的影響Fig.2 Effect of EGH on insulin secretion of T2DM model mice注：與空白對(duì)照組相比，***P<0.001；與模型組相比， #P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。Note:Compared with control group,***P<0.001;compared with model group,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001.

3.4 MTT法檢測(cè)滇結(jié)香花提取物對(duì)RIN-m5F損傷細(xì)胞存活率的影響

如圖3結(jié)果顯示，采用0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖的模型組顯著降低細(xì)胞存活率(**P<0.01)。經(jīng)過(guò).100～200 μg/mL EGH處理后，與模型組相比細(xì)胞存活率明顯上升(#P<0.05)。

圖3 EGH對(duì)Rin-m5F損傷細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of EGH on cell viability in RIN-m5F cells注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05。Note:Compared with control group,**P<0.01;compared with model group,#P<0.05.

3.5 DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)滇結(jié)香花提取物對(duì)RIN-m5F細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的胰島損傷細(xì)胞模型以活性氧生成量為檢測(cè)指標(biāo)評(píng)價(jià)不同濃度滇結(jié)香花正己烷提取物對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)作用。如圖4，與空白對(duì)照組相比，模型組ROS生成量顯著增加(***P< 0.001)；與模型組相比，EGH作用RIN-m5F細(xì)胞后ROS生成量顯著降低且呈劑量依賴性。

圖4 滇結(jié)香花提取物對(duì)RIN-m5F損傷細(xì)胞ROS的影響Fig.4 Effect of extrations of E.gardneri. on ROS in RIN-m5F injury cells注：與空白對(duì)照組相比，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。Note:Compared with control group,***P<0.001;compared with model group,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001.

3.6 qRT-PCR法檢測(cè)caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄

β細(xì)胞損傷時(shí)，可能觸發(fā)了凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。如圖5所示，當(dāng)0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30mmol/L葡萄糖作用后，與空白對(duì)照組相比，模型組caspase-3基因表達(dá)水平增加；與模型組相比，100 μg/mL EGH能明顯降低caspase-3基因表達(dá)水平(##P<0.01)。

3.7 Western blot法檢測(cè)胰島損傷和凋亡信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

PI3K/AKT信號(hào)通路是與胰島素信號(hào)相關(guān)的一條信號(hào)通路，它參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種活動(dòng)[13]。如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，模型組p-AKT、p-FOXO1蛋白水平明顯下調(diào)，p-JNK蛋白水平明顯上調(diào)(***P< 0.001)。在濃度為100 μg/mL的EGH作用RIN-m5F細(xì)胞后，AKT、FOXO1蛋白磷酸化水平升高，JNK蛋白磷酸化水平降低(##P<0.01)，證明EGH可以激活A(yù)KT抑制FOXO1，導(dǎo)致FOXO1從細(xì)胞核移位到細(xì)胞質(zhì)，從而使FOXO1失活[14]。同時(shí)抑制JNK的激活，保護(hù)β細(xì)胞免受氧化應(yīng)激影響。

圖5 EGH對(duì)RIN-m5F細(xì)胞caspase-3基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.5 Effect ofEGH on transcription level of caspase-3 gene in RIN-m5F cells注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比， ##P<0.01。Note:Compared with control group,***P<0.001;compared with model group,##P<0.01.

圖6 滇結(jié)香花提取物對(duì)RIN-m5F損傷細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響。(a)AKT;(b)FOXO1;(c)JNKFig.6 Effect of extrations of E.gardneri. on revelant protein in RIN-m5F injury cells.(a) AKT;(b) FOXO1;(c) JNK注：與空白對(duì)照組相比，***P<0.001；與模型組相比， ##P<0.01。Note:Compared with control group,***P<0.001;Compared with model group,##P<0.01.

4 討論

糖尿病胰島β細(xì)胞的功能障礙及數(shù)量減少是2型糖尿病(T2DM)的主要發(fā)病原因。伴隨著營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩以及肥胖的發(fā)生，人體血漿中葡萄糖和游離脂肪酸的水平明顯増加。糖毒性和脂毒性是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰竭的重要病理因素，但其損傷機(jī)制至今尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)室前期研究報(bào)道滇結(jié)香花提取物通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性等方面治療T2DM[7]。滇結(jié)香花水提取物展現(xiàn)出良好的降糖活性。實(shí)驗(yàn)同時(shí)還發(fā)現(xiàn)對(duì)損傷胰島組織也有一定的修復(fù)作用，提示利用胰島損傷的體內(nèi)和體外模型對(duì)滇結(jié)香花中保護(hù)胰島的物質(zhì)進(jìn)行篩選并探究其機(jī)制是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)空腹血糖、糖化血紅蛋白和胰島素分泌等指標(biāo)證實(shí)滇結(jié)香花正己烷提取物能明顯降低糖尿病小鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白和口服糖耐量，并提高胰島素水平。

本試驗(yàn)結(jié)果提示滇結(jié)香花正己烷提取物可以改善損傷的RIN-m5F細(xì)胞存活率，降低活性氧(ROS)生成量。而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期高血糖和高游離脂肪酸引起氧化應(yīng)激和的ROS加速產(chǎn)生，導(dǎo)致胰島細(xì)胞損傷和凋亡，降低胰島素基因的表達(dá)，減少胰島素分泌[15]。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡途徑中caspase依賴性途徑中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其活化和含量的提高意味著凋亡的加強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)了EGH與模型組相比能夠減少caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄水平，提示EGH對(duì)損傷的RIN-m5F細(xì)胞具有抗凋亡的作用。

氧化應(yīng)激的發(fā)生通常包含了多條信號(hào)通路，如PI3K/AKT途徑。PI3K/AKT通過(guò)下游多種途徑對(duì)靶蛋白進(jìn)行磷酸化而發(fā)揮抗凋亡作用，例如胰島β細(xì)胞中特異性過(guò)表達(dá)AKT可導(dǎo)致β細(xì)胞數(shù)目和大小的顯著增加[16]。 AKT還是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體連接水平調(diào)節(jié)的關(guān)鍵激酶，通過(guò)調(diào)控IP3R1磷酸化水平，進(jìn)而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的釋放。而鈣離子在葡萄糖促進(jìn)胰島素釋放中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[17]。FOXO1轉(zhuǎn)錄因子是控制細(xì)胞周期的重要分子，其核內(nèi)定位導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。這些均證明AKT/FOXO1信號(hào)通路在PA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用。C-Jun N-末端激酶(JNK)在各種細(xì)胞類型(包括胰腺β細(xì)胞)中被氧化應(yīng)激激活?，F(xiàn)有證據(jù)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激通過(guò)激活JNK，從而抑制胰島素生物合成和干擾胰島素作用通路[19]。因此JNK在胰島β細(xì)胞功能障礙和凋亡以及胰島素抵抗中起著關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)濃度為100 μg/mL的EGH處理后，細(xì)胞內(nèi)AKT、FOXO1蛋白磷酸化水平升高，JNK蛋白磷酸化水平降低，證明EGH可以激活A(yù)KT抑制FOXO1，導(dǎo)致FOXO1從細(xì)胞核移位到細(xì)胞質(zhì)，從而使FOXO1失活。同時(shí)抑制JNK的激活，減少氧化應(yīng)激對(duì)β細(xì)胞的影響，抑制凋亡。