潘 興，王黎青，楊遠霞

0 引言

阿托伐他汀(Atorvastatin)自1999年在中國上市以來，是中國使用最廣泛的降脂藥物，約占心血管疾病二級預防總他汀用量的40%[1-2]。同時也是世界上使用最廣泛的他汀類藥物[3]。小檗堿(Berberine)是從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取分離出的生物堿，也叫黃連素[4]，對細菌有微弱的抑菌作用，對痢疾桿菌、大腸桿菌引起的腸道感染有效。近年來的研究表明，小檗堿還有降脂作用[5]，其可能機制是通過抑制肝臟PCSK9的活性，使LDL-C受體表達增加，進而減少血清中LDL-C水平；還可以通過激活AMP激酶和阻斷MAPK/ERK通路來降低三酰甘油水平[6]。由于小檗堿與他汀類不同的降血脂機制，小檗堿與阿托伐他汀聯合用藥的文獻報道較多[7-9]。同時，較多的文獻表明，小檗堿對體內外細胞色素P450 3A(CYP3A)及P-糖蛋白(P-gp)均存在一定的影響，但因小檗堿給藥劑量不同、研究方法不同，其結論不同甚至相反[10-14]。阿托伐他汀作為CYP3A4與P-gp的共同底物[15]，與小檗堿聯合用藥時很有可能產生藥物相互作用。本研究探討小檗堿對阿托伐他汀鈣體內藥代動力學的影響，以指導臨床合理聯合用藥。

1 材料

1.1 藥品及試劑 阿托伐他汀鈣片(規(guī)格：20 mg/片，批號：T28958，輝瑞制藥有限公司)；鹽酸小檗堿片(規(guī)格：0.1 g/片，批號：2170440，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)；阿托伐他汀鈣標準品(HPLC>98%，購自大連美侖生物技術有限公司，批號：J1203AS)；乙腈(色譜級，BCR國際貿易公司)；甲醇(色譜級，BCR國際貿易公司)；氯化鈉(分析純，天津市大茂化學試劑廠，批號：20170401)；磷酸二氫鈉(分析純，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10102702)；磷酸(分析純，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10113901)；純凈水(實驗室自制雙蒸水)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司Agilent 1100系列)；安捷倫色譜柱 Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)；Eppendorf Centrifuge 5415R-小型高速冷凍離心機(德國EPPENDORF公司)；XW-80A型漩渦振蕩混合器(上海第一醫(yī)學院儀器廠)；十萬分之一電子分析天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；KQ-600DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；4 ℃冰箱(新飛電器集團有限公司)；-20 ℃冰箱(美國Revco立式超低溫冰箱)；-80 ℃冰箱(美國NBS公司)。

1.3 動物 SPF級SD雄性大鼠，體重350～380 g，采購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2016-0041，編號：44002100015649。動物飼養(yǎng)于無毒塑料盒中，每盒6只，每3天更換一次墊料，自由攝食和進水，保持室內溫度18～29 ℃，相對濕度40%～70%，自然光照。正常飼養(yǎng)1周后使用。每次給藥前禁食12 h，給藥后禁食2 h，不禁水。

1.4 藥液配置 阿托伐他汀鈣標準儲備液：精密稱取阿托伐他汀鈣5.0 mg，至10 ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得阿托伐他汀鈣儲備液500 μg/ml，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。飽和氯化鈉溶液：量取50 ml純凈水，加入氯化鈉直至飽和，4 ℃儲存?zhèn)溆?。灌胃給藥用阿托伐他汀鈣：取阿托伐他汀鈣片3片(60 mg)置于小燒杯中，加入20 ml蒸餾水，使用玻璃棒不停攪動，使其均勻分散于水中，配置為3 mg/ml的阿托伐他汀鈣混懸液，使用前搖勻。灌胃給藥用鹽酸小檗堿：取鹽酸小檗堿片2片(200 mg)置于小燒杯中，加入10 ml蒸餾水，使用玻璃棒不停攪動，使其均勻分散于水中，配制為20 mg/ml的鹽酸小檗堿混懸液，使用前搖勻。

2 方法

2.1 給藥方案 SD健康雄性大鼠共30只，隨機分為5組：A組單獨以阿托伐他汀鈣20 mg/kg的劑量灌胃；B組先予小檗堿30 mg/kg灌胃，5 min后阿托伐他汀鈣20 mg/kg相繼灌胃；C組先予小檗堿90 mg/kg灌胃，5 min后阿托伐他汀鈣20 mg/kg相繼灌胃；D組以小檗堿30 mg/kg連續(xù)灌胃6 d，在第7天灌胃給藥小檗堿5 min后，以20 mg/kg阿托伐他汀鈣灌胃給藥；E組以小檗堿90 mg/kg連續(xù)灌胃6 d，在第7天灌胃給藥小檗堿5 min后，以20 mg/kg阿托伐他汀鈣灌胃給藥。于阿托伐他汀鈣給藥前及給藥后0 min、10 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h眼眶采血約300 μl，收集于含肝素的1.5 ml離心管中，在3 600 r/min離心10 min，分離上清液，于-80 ℃留存，用于阿托伐他汀鈣含量檢測。

2.2 血漿樣品處理 精密量取100 μl血漿樣品，置于1.5 ml塑料離心管中，加入250 μl乙腈，50 μl 飽和氯化鈉溶液，漩渦混合1 min，12 000 r/min離心10 min，取200 μl上清液于1.5 ml離心管中，自然揮干，用30 μl乙腈復溶，旋渦混合30 s，取20 μl進樣分析。

2.3 色譜條件 色譜柱：安捷倫Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)；流動相：水(0.01 mol/L的磷酸二氫鈉，pH=3.3)-乙腈=30∶70；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl；檢測波長：245 nm。

2.4 方法學驗證

2.4.1 特異性考察 通過比較來自6只不同SD大鼠的空白血漿色譜圖，加入阿托伐他汀鈣標準品的空白血漿色譜圖以及血漿樣品的色譜圖來反映方法的特異性。檢測血漿中是否有代謝產物、雜質、分解產物、基質組分等干擾樣品的檢測。

2.4.2 標準曲線及定量范圍 取阿托伐他汀鈣的標準儲備液適量，用乙腈逐級稀釋成濃度為20、16、8、4、2、1、0.6 μg/ml的阿托伐他汀鈣溶液。分別取上述各濃度的阿托伐他汀鈣溶液各10 μl，加入100 μl的空白血漿，分別配成阿托伐他汀鈣終濃度為2 000、1 600、800、400、200、100、60 ng/ml的標準樣品。按“2.2”項下方法處理樣品，按“2.3”項下色譜條件進行檢測。以阿托伐他汀鈣標準樣品的峰面積Y為縱坐標，濃度X為橫坐標作圖，采用最小二乘法計算線性回歸方程的斜率、截距、相關系數，獲得標準曲線。標準曲線高低濃度范圍為定量范圍。定量下限的信噪比(S/N)不小于10。

2.4.3 準確度和精密度考察 取阿托伐他汀鈣的標準儲備液適量，用乙腈分別稀釋成濃度為15、5、1.5 μg/ml的阿托伐他汀鈣溶液。分別取以上各濃度的阿托伐他汀鈣溶液各10 μl，加入100 μl的空白血漿，分別配成阿托伐他汀鈣終濃度為1 500、500、150 ng/ml的質控樣品溶液。按“2.2”項下方法處理樣品，按“2.3”項下色譜條件同一天內進樣5份，計算日內精密度和準確度；連續(xù)3 d內每天進樣1份，計算日間精密度和準確度。準確度表示為：測量值/真實值×100%，精密度表示為：測量值的相對標準偏差(RSD)。準確度應在85%～115%范圍內，在定量下限附近應在80%～120%范圍內。精密度應<15%，在定量下限附近應<20%。

2.4.4 提取回收率考察 取阿托伐他汀鈣的標準儲備液適量，用乙腈分別稀釋成濃度為15、5、1.5 μg/ml的阿托伐他汀鈣溶液。分別取以上各濃度的阿托伐他汀鈣溶液各10 μl，加入100 μl的乙腈(代替空白血漿)，分別配成阿托伐他汀鈣終濃度為1 500、500、150 ng/ml的樣品溶液，每個濃度平行操作5份。按“2.2”項下方法處理樣品(加入150 μl乙腈)，按“2.3”項下色譜條件同一天內進樣，將“2.4.3”項下操作測得的平均峰面積與此次檢測得到平均峰面積相比，即得提取回收率，其結果應精密和可重現。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 同“2.4.3”配置阿托伐他汀鈣終濃度為1 500、500、150 ng/ml的質控樣品溶液。按“2.2”項下方法處理樣品，分別放置于室溫4 h和24 h，-80 ℃凍存3 d和7 d，按“2.3”項下色譜條件進行檢測，每次檢測樣品平行操作3份，考察樣品處理后阿托伐他汀鈣的室溫和凍存穩(wěn)定性。

3 結果

3.1 特異性 大鼠的空白血漿色譜圖、加入阿托伐他汀鈣標準品的空白血漿色譜圖以及血漿樣品的色譜圖見圖1，從圖中可以看出，待測樣品峰形良好，與前后峰的分離度均>2(R>2)，符合檢測要求。

圖1 血漿樣品中阿托伐他汀鈣典型色譜圖

3.2 標準曲線及定量范圍 以阿托伐他汀鈣標準樣品的峰面積為Y軸，濃度為X軸，采用最小二乘法進行線性回歸，得到阿托伐他汀鈣的標準曲線為Y=0.096 7 X+6.119 7，相關系數為R2=0.999 8，標準曲線滿足生物樣品分析的要求。定量范圍為60～2 000 ng/ml，定量下限為60 ng/ml。

3.3 準確度和精密度 血漿中阿托伐他汀鈣的3個質控樣品(1 500、500、150 ng/ml)的日內及日間準確度和精密度見表1，結果表明，本方法的精密度和準確度滿足要求。

表1 血漿中阿托伐他汀鈣的日內和日間精密度及準確度

3.4 提取回收率 阿托伐他汀鈣的3個質控濃度(1 500、500、150 ng/ml)在血漿中的提取回收率在87.1%～95.0%之間，表明該方法對血漿中阿托伐他汀鈣具有良好的提取回收率。見表2。

表2 阿托伐他汀鈣在血漿樣品中的回收率

3.5 穩(wěn)定性 經過測定，阿托伐他汀鈣的3個質控濃度(1 500、500、150 ng/ml)樣品處理后在室溫下放置4 h和24 h，-80 ℃凍存3 d和7 d，所有樣品的穩(wěn)定性均在15%以內。

3.6 藥動學研究

3.6.1 大鼠單次灌胃小檗堿對阿托伐他汀鈣的藥代動力學影響 大鼠單次灌胃阿托伐他汀鈣(A組)、單次小劑量小檗堿+阿托伐他汀鈣(B組)及單次大劑量小檗堿+阿托伐他汀鈣(C組)的血藥濃度-時間曲線見圖2，各組藥代動力學參數見表3。

圖2 大鼠單次灌胃小檗堿后體內阿托伐他汀鈣藥時曲線

表3 大鼠單次灌胃小檗堿后阿托伐他汀鈣的藥動學參數

3.6.2 大鼠多次灌胃小檗堿對阿托伐他汀鈣的藥代動力學影響 大鼠單次灌胃阿托伐他汀鈣(A組)、多次小劑量小檗堿+單次阿托伐他汀鈣(D組)及多次大劑量小檗堿+單次阿托伐他汀鈣(E組)的血藥濃度-時間曲線見圖3，各組藥代動力學參數見表4。

表4 大鼠多次灌胃小檗堿后阿托伐他汀鈣的藥動學參數

圖3 大鼠多次灌胃小檗堿后體內阿托伐他汀鈣藥時曲線

4 討論

近年來，雙重藥物相互作用的概念，特別是涉及P-gp和CYP3A的概念，受到了廣泛關注[16-17]。腸壁細胞中CYP3A介導的藥物代謝和P-gp介導的藥物逆轉運，限制了進入全身循環(huán)的藥物總量，降低了藥物的口服生物利用度。而且腸道中P-gp和CYP3A4之間存在相互影響，P-gp通過延長藥物與CYP3A4酶的接觸，降低藥物的跨細胞轉運，從而增加藥物被腸壁CYP3A4代謝的機會，并影響藥物代謝的程度[18]。作為P-gp和CYP3A4的雙重底物，阿托伐他汀存在多樣性的藥物相互作用，據統(tǒng)計，目前已發(fā)現461個藥物會與阿托伐他汀發(fā)生藥物相互作用[15]。因此，在阿托伐他汀的聯合用藥過程中，應特別注意藥物相互作用的影響，尤其與P-gp和/或CYP3A4的抑制劑/誘導劑合用時。

小檗堿通常被認為是安全無毒的[19]，但在臨床應用過程中有發(fā)生不良反應致死的報道[20]，也發(fā)現了很多的藥物相互作用[21-22]。深入研究發(fā)現，小檗堿所導致的藥物相互作用主要與其影響CYP450酶和P-gp的活性有關，但對于P-gp和CYP3A的影響，各項研究的結論有所不同[10-14]。自研究者發(fā)現了小檗堿的降脂作用后，在臨床將其與阿托伐他汀鈣聯合用藥的情況越來越多，因此，研究兩者之間的藥物相互作用是十分必要的。

在本研究中，我們將成人鹽酸小檗堿片的正常用量換算為大鼠的給藥劑量，研究小檗堿在正常劑量給藥下對阿托伐他汀鈣藥代動力學的影響。研究結果表明，大鼠在單次及多次灌胃不同劑量的小檗堿后，阿托伐他汀鈣體內藥代動力學參數的改變無統(tǒng)計學意義，雖然多次給予大劑量小檗堿(90 mg/kg)后，阿托伐他汀鈣的Cmax及AUC均有不同程度的升高，但與單用阿托伐他汀鈣相比差異無統(tǒng)計學意義。研究結果與小檗堿對辛伐他汀的藥動學影響類似[23]。本研究結果提示，臨床在聯合使用兩藥時，正常用量下小檗堿可能不會對阿托伐他汀鈣的藥動學造成影響，但由于本研究是在大鼠體內進行的，與人體內的藥動學變化是否一致，仍需進一步的研究。