李 翔，黎春彤，張曉娟，段斯庭，劉皈陽，馬建麗

0 引言

健骨顆粒為解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心制劑室自制，由骨碎補、黃芪、土鱉蟲、三七、梔子和海螵蛸共六味藥材構(gòu)成，用于對骨折、跌打損傷及骨質(zhì)疏松等常見疾病的治療，該藥物臨床應(yīng)用多年，療效顯著、安全性高。但目前健骨顆粒的質(zhì)量控制多以單一藥物成分或活性成分鑒別為主，缺乏準確、可靠的質(zhì)量標準，需建立和完善其質(zhì)量標準，以有效控制藥品質(zhì)量、保證藥品安全。本研究對健骨顆粒開展了骨碎補、黃芪、土鱉蟲、三七和梔子的薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法對君藥骨碎補中柚皮苷的含量進行控制，對該制劑的質(zhì)量標準進行全面提升，所建立的方法簡便、準確、重復性好，能夠更加全面地反映制劑的質(zhì)量和保證制劑安全。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，ChemStation化學工作站(美國安捷倫公司)；Linomat 5半自動點樣儀(瑞士卡瑪)；AE200型電子天平；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器；ZF-90暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠)。

1.2 試藥和材料 健骨顆粒(批號：20180301、20180308、20180315，解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心)；對照藥材：骨碎補(批號：121169-201304，中國藥品生物制品檢定所)，黃芪(批號：121464-201304)、土鱉蟲(批號：121533-201303)、三七(批號：120941-200405)、梔子(批號：120986-201309)；對照品：柚皮苷(批號：0722-9805)、黃芪甲苷(批號：0781-9807)、三七皂苷R1(批號：110745-200617)、人參皂苷Rg1(批號：0703-200118)、人參皂苷Rb1(批號：110704-200217)、梔子苷(批號：110749-201316)均購于中國食品藥品檢定研究院；水為娃哈哈純凈水；甲醇為色譜純、磷酸為分析純；德國默克硅膠G60高效薄層板(德國Merck)。

2 薄層色譜鑒別

2.1 供試品溶液、對照藥材溶液和空白對照溶液的制備 取健骨顆粒2 g，分別按照表1方法制備3份供試品，作為供試品溶液1～3，分別用于骨碎補、黃芪、土鱉蟲、三七和梔子的薄層鑒別。取骨碎補、梔子、土鱉蟲、三七和黃芪對照藥材各0.5 g，同法制得相應(yīng)的對照藥材溶液。另按處方比例分別制備缺骨碎補、黃芪、土鱉蟲、三七和梔子的陰性對照品，同法制成陰性對照品溶液，結(jié)果見表1。

2.2 標準品溶液的配制 取對照品柚皮苷、黃芪甲苷、梔子苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1，分別加甲醇制成1～2 mg/ml的溶液，作為骨碎補、黃芪、三七和梔子薄層鑒別的對照品溶液。

2.3 骨碎補、黃芪、土鱉蟲、三七和梔子的薄層色譜鑒別 分別吸取供試品、對照藥材、對照品和陰性對照品溶液按照表1中色譜條件進行薄層鑒別實驗。結(jié)果見圖1。

表1 薄層鑒別色譜條件表

圖1 TLC鑒別結(jié)果

注：A.骨碎補的TLC圖譜；B.黃芪的TLC圖譜；C.三七的TLC圖譜(可見光)；D.三七的TLC圖譜(紫外)；E.梔子的TLC圖譜；F.土鱉蟲的TLC圖譜。1.健骨顆粒(20180301)樣品；2.對照藥材；圖A中，3.柚皮苷對照品，4.缺骨碎補的陰性樣品；圖B中，3.黃芪甲苷對照品，4.缺黃芪的陰性樣品；圖C、D中，3.混合對照品，4.人參皂苷Rb1對照品，5.三七皂苷R1對照品，6.人參皂苷Rg1對照品，7.缺三七的陰性樣品；圖E中，3.梔子苷對照品，4.缺梔子的陰性樣品；圖F中，3.缺土鱉蟲的陰性樣品

3 含量測定

3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液(40∶60)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：283 nm；進樣量：10 μl；理論塔板數(shù)：按柚皮苷不得低于1 000。

3.2 溶液制備 對照品溶液的制備：取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l ml含61.44 μg/ml的溶液，即得對照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱量健骨顆粒內(nèi)容物1 g，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理30 min，放置到室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量；取2.5 ml置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。陰性對照溶液的制備：取薄層鑒別制備缺骨碎補的陰性對照樣品，按照供試品溶液的制備項下方法制備成缺骨碎補的陰性對照溶液。

3.3 專屬性實驗 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照樣品溶液，按“3.1”項下色譜條件測定，結(jié)果樣品中柚皮苷峰與其他組分色譜峰能達到基線分離，陰性對照液中色譜峰對測定無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 健骨顆粒的HPLC圖譜

3.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0 ml，分別加甲醇稀釋至10 ml，即為不同濃度的對照溶液。按“3.1”項下色譜條件分析，以濃度為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結(jié)果線性方程為Y=17.984 X+5.824，柚皮苷在3.072～61.44 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好(r=0.999 9)。

3.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按“3.1”項下條件連續(xù)進樣6次進行測定，計算柚皮苷峰面積的RSD為0.54%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復性試驗 取健骨顆粒(批號：20180301)，按“3.2”項下供試品溶液方法制備6份溶液，按“3.1”項下色譜條件分別進樣進行分析。結(jié)果柚皮苷的平均含量為3.556 1 mg/g，RSD為0.97%(n=6)，表明方法重復性良好。

3.7 樣品溶液穩(wěn)定性試驗 健骨顆粒(批號：20180301)樣品，按“3.2”項下供試品溶液方法制備，分別于0、2、4、6、8、12 h后進樣，按“3.1”項下色譜條件分析測定，以峰面積計算。結(jié)果柚皮苷的RSD為0.81%，表明供試品在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3.8 回收率試驗 精密量取已知含量(柚皮苷3.556 1 mg/g)的健骨顆粒6份，精密加入8.2 ml的柚皮苷對照品溶液，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，依“3.1”項下色譜條件進樣分析，計算回收率。結(jié)果顯示，該色譜條件下柚皮苷的平均回收率為99.92%，RSD為1.53%，結(jié)果見表2。

3.9 樣品含量測定及耐用性實驗 樣品含量測定：取健骨顆粒樣品3批(批號：20180301、20180308、20180315)，按“3.2”項方法制備供試品溶液，按“3.1”項色譜條件對柚皮苷的含量進行測定(n=3)，3批樣品中柚皮苷的含量結(jié)果見表3。

耐用性實驗：取健骨顆粒(批號：20180301)供試品，照“3.2”項下方法制備供試品溶液。對改變色譜柱進行了考察。兩種不同色譜柱對比：以1批號(20180301)健骨顆粒樣品試驗，比較色譜柱Agilent ZORBA XSB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)的分離狀態(tài)和測定結(jié)果，表明該方法適用于多個型號的C18色譜柱。

4 討論

本制劑處方來自民間驗方，具有活血化瘀、補腎接骨之功效。經(jīng)多年臨床經(jīng)驗證明，療效確切、治愈率高，安全可靠。對骨折、跌打損傷、骨質(zhì)疏松等臨床常見疾病有良好療效。筋斷骨折，血不循經(jīng)，總致瘀血在內(nèi)而不散，血不活則瘀不能去，瘀不散則骨折不續(xù)，而肝主筋，腎主骨，尤以腎為最要，腎精充足則骨髓生化有源，對骨骼的生長發(fā)育以及骨折后的修復發(fā)揮重要作用，故本方立法于活血化瘀，補腎接骨。骨碎補苦溫，補腎強骨[1-2]；土鱉蟲咸溫，性善走竄攻沖，破血逐瘀，續(xù)筋接骨，二者共為君藥[3-4]。黃芪甘溫益氣，與活血藥共用[5]；海螵蛸咸澀微溫，收斂止血，中含大量鈣質(zhì)，為骨之修復所必須，與黃芪共為臣藥[6]。瘀血內(nèi)阻，易化熱，梔子正可用其清涼之性以清熱，是為佐藥[7]。三七味甘，微苦，歸肝、胃經(jīng)，散淤止痛，消腫止痛，是為使藥[8]。本研究對制劑處方中的骨碎補、黃芪、梔子、三七和土鱉蟲進行了薄層鑒別研究，并取得了理想的鑒別效果，其中未鑒別的海螵蛸的主要成分為無機成分碳酸鈣，可參考中國藥典中化學鑒別法，不宜采用薄層法鑒別[9]。本研究采用高效液相色譜法，對其中柚皮苷進行了含量測定。骨碎補為健骨顆粒中的君藥，具有治療傷筋動骨、抗骨質(zhì)疏松、促進骨折愈合的功效，骨碎補的主要成分柚皮苷，可作為定量檢測的指標性成分。

表2 樣品回收率試驗結(jié)果

表3 含量測定結(jié)果

在對骨碎補的薄層鑒別方法進行考察時，原標準中以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(1∶12∶2.5∶3)上層溶液為展開劑。由于甲苯毒性較強，用毒性較小的環(huán)己烷代替同樣能達到較好的分離效果。但在這個條件下，薄層板下邊變黑，經(jīng)驗證，是甲酸含量高導致。所以參考了藥典中枳殼薄層鑒別的條件，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)的下層溶液為展開劑，同樣，由于三氯甲烷為明確的致癌物，將三氯甲烷替換為二氯甲烷，最終展開結(jié)果相似。雖然各成分得到分離，但經(jīng)計算，比移值偏大[9]。所以將展開劑的比例調(diào)整為二氯甲烷-甲醇-水(8∶2∶0.5)，最終獲得較好的分離效果。

5 結(jié)論

本實驗方法簡便、準確，通過對健骨顆粒的質(zhì)量標準研究，為其質(zhì)量控制提供了可靠依據(jù)。用顯微鑒別的方法，用薄層色譜法對骨碎補、黃芪、梔子、三七和土鱉蟲進行鑒別，特征斑點分離明顯，陰性無干擾；柚皮苷在3.072～61.44 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，平均回收率為99.92%，平均RSD為1.53%(n=6)，該方法適用于健骨顆粒中柚皮苷含量測定。