1株降解磺化瀝青菌株的篩選與鑒定

幸晶晶

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

江濤

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

磺化瀝青是一種以瀝青為原料，經(jīng)磺化處理后得到的改性高分子化合物，是一種既可以部分溶于水又溶于油的棕黑色物質(zhì)，能夠分散在泥漿中起到良好的護(hù)壁和防塌效果[1，2]，具有良好的堵漏、防塌、潤(rùn)滑、減阻、控溫等性能，曾作為水基鉆井液，應(yīng)用廣泛。其主要成分為瀝青磺酸鹽、少量的瀝青酚鹽、無機(jī)物、氧化瀝青、飽和烴及單、雙環(huán)、多環(huán)芳烴等[3]，具有高色度、高化學(xué)需氧量(COD)、可生化性差等特點(diǎn)，屬于難降解有機(jī)物[4]。針對(duì)于包含磺化瀝青的鉆井液的污染物降解，目前處理方法主要有化學(xué)法、物化法、生物法組合和工藝處理法4大類[5～10]，并都取得了較好的降解效果，但工藝較復(fù)雜、成本高，且容易產(chǎn)生二次污染。隨著微生物處理技術(shù)的深化研究和工程實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，微生物處理技術(shù)在有毒、有害的有機(jī)工業(yè)廢水中的治理中具有成本低、降解完全、工藝簡(jiǎn)單、無二次污染等明顯優(yōu)勢(shì)，得到了廣泛的應(yīng)用[11～14]。為此，本研究對(duì)降解磺化瀝青的菌株進(jìn)行了篩選與鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

磺化瀝青粉和鉆井泥漿由新疆克拉瑪依某油田提供，原材料及水溶液狀態(tài)分別如圖1、圖2所示。菌種來源于新疆克拉瑪依油田鉆井泥漿。

篩選培養(yǎng)基配方：硝酸鈉1.5g、硫酸銨1.5g、磷酸氫二鉀1.0g、七水硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g、氯化鈉5.0g、七水硫酸亞鐵0.01g、氯化鈣0.02g、超純水1L、聚磺物(瀝青)(0.05%)0.5g。

富集培養(yǎng)基配方：牛肉膏5g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，瓊脂20g，超純水1L，pH=7。

1.2 菌種篩選

1)菌種的初篩 將采自于新疆克拉瑪依油田內(nèi)的鉆井泥漿，稱取1g接入到篩選培養(yǎng)基中。以5d為1個(gè)周期，馴化培養(yǎng)5個(gè)周期后進(jìn)行稀釋平板涂布。馴化條件為35℃、150r/min。挑選菌落大小和顏色有差異的菌株作為初篩菌種。

2)菌種的復(fù)篩 將初篩菌落先接種至富集培養(yǎng)基在條件為35℃、150r/min進(jìn)行富集擴(kuò)大培養(yǎng)，吸取1mL富集菌液回接到液體篩選培養(yǎng)基中以5d為1個(gè)周期，馴化培養(yǎng)5個(gè)周期后，挑選生長(zhǎng)良好的單菌落培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋涂布至固體篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，再經(jīng)顯微鏡觀察菌株形態(tài)，得到菌落形態(tài)不同和菌體形態(tài)存在差異的復(fù)篩菌株。

圖1 磺化瀝青圖2 磺化瀝青水溶液

1.3 DNA提取

將篩選的菌種接到裝有固體富集培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，生長(zhǎng)48h后，挑選其中一個(gè)單菌落進(jìn)行DNA提取。DNA提取方法為微波提取法，接一環(huán)菌落到裝有50μL無菌水的EP管中，混勻。微波中火加熱2 min后快速取出冰浴2min。

1.4 PCR擴(kuò)增

16s rDNA上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R：5’-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR 擴(kuò)增體系為50μL：2×Taq PCR Master Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板4μL，無菌水17μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后送于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

將馴化的混合菌液稀釋涂布進(jìn)行初篩獲得135個(gè)長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落。再經(jīng)回接、純化和形態(tài)觀察進(jìn)行復(fù)篩，得到6株生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的單菌落。挑選其中生長(zhǎng)速度最快且長(zhǎng)勢(shì)最佳的菌株作為試驗(yàn)菌，命名為X2。

2.2 菌種的形態(tài)學(xué)鑒定

X2菌種菌落呈圓形，表面光滑，白色。挑選單菌落進(jìn)行染色后觀察，發(fā)現(xiàn)X2呈桿狀，為革蘭氏陽性菌。結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 X2單菌落圖4 X2菌株鏡檢圖

2.3 菌種的分子生物學(xué)鑒定

將菌種X2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增樣品經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，得到以下片段：

圖5 菌株X2系統(tǒng)發(fā)育樹

將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast對(duì)比，結(jié)果顯示X2菌株的DNA與FJ938121.1_Bacillus_sp._210_10菌株的相似度高達(dá)99.79%，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，可以判定菌種X2屬芽孢桿菌屬(Bacillus)。

3 小結(jié)

經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到6株優(yōu)良單菌，挑選其中1株長(zhǎng)勢(shì)最佳的菌株(命名為X2)進(jìn)行形態(tài)觀察及分子鑒定，判定菌種X2屬芽孢桿菌屬(Bacillus)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步的降解研究奠定了基礎(chǔ)。