紀凌云， 周愛萍， 馬 俊， 金 寧， 譚光坤， 吳文娟

作者單位：同濟大學附屬東方醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，上海 200123。

近年來，隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的廣泛應用，以及各種介入診療、器官移植的大量開展，念珠菌病的發(fā)病率逐漸升高。據(jù)相關統(tǒng)計，發(fā)生侵襲性念珠菌感染的患者達25萬例/年，死亡病例超過5萬例，年發(fā)病率在（2～14）/100 000[1-2]。白念珠菌是一種定植在正常人群口腔黏膜、上呼吸道、腸道及陰道等部位的酵母樣真菌，為條件致病性真菌。近十年來，越來越多的其他念珠菌種被發(fā)現(xiàn)或成為重要的病原菌，使得菌種分布發(fā)生了變化，但白念珠菌占比達50%，仍占主要地位[3]。唑類藥物是目前治療白念珠菌感染的首選藥物，隨著長期廣泛大量使用，對其耐藥導致治療失敗的病例逐漸增多。本文就白念珠菌耐藥相關機制的研究進展進行綜述，并探討非整倍體事件、適應性、生物膜形成與耐藥形成的聯(lián)系，為抗真菌藥物的研制提供新的作用靶位。

1 麥角固醇合成相關基因

麥角固醇是維持白念珠菌細胞膜完整性和流動性的重要組成部分，CYP51是其生物合成的靶酶，可催化羊毛甾醇去甲基化形成麥角固醇，且該反應離不開氧和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，還原型輔酶Ⅱ）。唑類藥物抗真菌的作用靶點即去甲基化酶CYP51，其通過易化擴散進入真菌細胞，并通過唑環(huán)中的無阻氮原子與位于CYP51蛋白活性位點血紅素的鐵原子結合，從而抑制麥角甾醇的生物合成而發(fā)揮抗真菌作用[4]。細胞色素P450是一個包含2 500多個成員的超家族，按功能可大致將其分為兩類，第一類主要參與有害物質(zhì)的代謝，而第二類通常參與關鍵的生物合成過程，如甾醇類[5]。CYP51是細胞色素P450家族中最古老的，它是該家族中唯一一個在動物、植物、細菌以及病毒中均存在的蛋白，盡管在不同生物中，CYP51蛋白序列一致性為22%～33%，發(fā)揮效用的晶體結構卻有許多相似之處，而白念珠菌和其他真菌在結構上最顯著的特征是在氨基酸428和459之間有一個附加的外環(huán)[4]。編碼CYP51的基因主要是ERG1～27，其中與耐藥相關的基因主要是ERG11，此外ERG3、ERG4、ERG5、ERG6與耐藥的相關性也有所報道[6-9]。

1.1 ERG11基因突變與過表達

ERG11基因突變可使唑類藥物抗真菌的作用靶點去甲基化酶CYP51的血紅素表面結合位點發(fā)生變化，從而使唑類藥物無法與真菌有效結合而致耐藥。據(jù)報道超過140個錯義突變存在于ERG11基因，表明其編碼產(chǎn)物去甲基化酶CYP51在結構上具有高度的可變性[10]。此外，只有部分錯義突變被明確證實與耐藥有關，且大部分已發(fā)現(xiàn)的耐藥株均含有多個錯義突變。早在1999年，這些錯義突變已被證實并非隨機分布在整個編碼區(qū)，多數(shù)集中在不同的“熱點”區(qū)，表現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平為：氨基酸突變位點區(qū)域105-165、266-287、405-488[6]。與唑類耐藥相關的ERG11突變位點見表1[4，6-7，10-11]。此外，ERG11基因突變位點具有地域相關性，特定區(qū)域具有相同的突變位點，未發(fā)生突變的分離株對于唑類藥物具有較低的最低抑菌濃度（MIC）值，總之，ERG11基因點突變在白念珠菌唑類耐藥中發(fā)揮重要作用[12]。值得注意的是，一些位點的ERG11基因突變在唑類敏感株和耐藥株中均可發(fā)生，故這些突變不影響其對唑類耐 藥。

ERG11基因過表達會導致去甲基化酶CYP51增多，白念珠菌胞內(nèi)的唑類藥物不能夠阻止過多的去甲基化酶CYP51與羊毛甾醇結合，無法影響麥角固醇的合成，從而導致白念珠菌耐藥[6，11]。ERG11基因過表達在白念珠菌臨床分離株中普遍存在，白念株菌唑類藥物耐藥機制中，ERG11基因過表達作用是最小的，或者與其他抗性突變機制聯(lián)合，使得菌株產(chǎn)生耐藥，因此難以評估這種過表達對耐藥表型的直接影響，且這種過表達往往涉及鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Upc2p，該轉(zhuǎn)錄因子在麥角固醇耗竭基礎上誘導產(chǎn)生[6]。文獻報道，UPC2基因的功能獲得性（gain-of-function，GOF）突變能夠改變其轉(zhuǎn)錄活性，導致ERG11基因的過表達，該研究結果顯示，在沒有藥物影響下，野生型與UPC2基因敲除株表現(xiàn)出相同的生長情況，在2 μg/ mL氟康唑作用下，UPC2基因敲除株生長與野生型相比受到嚴重損害[13]。UPC2基因的GOF突變可導致白念珠菌對唑類藥物耐藥，據(jù)報道轉(zhuǎn)錄因子UPC2中的A643V、G648D、G648S和Y642F位點的氨基酸置換與ERG11基因的過表達有關，而且UPC2基因的GOF突變在臨床分離的耐藥株中普遍存在[14]。此外，也有報道稱，ERG11基因過表達僅發(fā)生在少數(shù)近平滑念珠菌臨床耐藥株中，且過表達不依賴UPC2基因突變。在光滑念珠菌的唑類耐藥機制中，ERG11過表達并不起重要作用，該機制在克柔念珠菌的唑類耐藥中的作用也尚不清楚[6]。因此，隨著研究的深入，UPC2基因更多新的GOF突變位點有待發(fā)現(xiàn)，對ERG11基因過表達的調(diào)控機制也會有更多全新認識。

表1 白念珠菌唑類耐藥相關的ERG11突變位點

1.2 其他ERG耐藥相關基因

ERG3基因位于ERG11基因上游，與甾醇生物合成的旁路途徑有關，引起氟康唑耐藥現(xiàn)象發(fā)生。該基因的功能缺失突變導致菌體不能生成有活性的甾醇△5，6-去飽和酶，菌體內(nèi)毒性麥角甾醇類物質(zhì)聚集，并且能夠維持菌株的正常生長，從而減弱唑類藥物對細胞壁的作用，該耐藥機制較罕見，已在實驗室誘導發(fā)生，并在臨床株中觀察到此現(xiàn)象[6]。ERG4基因編碼甾醇C-24（28）還原酶，在釀酒酵母中過表達可升高麥角甾醇含量。據(jù)報道，ERG4及ERG11基因突變及過表達發(fā)生在唑類耐藥株中，且ERG4在唑類耐藥株中存在2個沉默突變（C711T和C435T），但不能確定此突變與耐藥相關[7]。此外，也有報道表明ERG5與唑類的耐藥性相關[9]，艾里莫芬倍半萜（eudesmane sesquiterpenes）能夠作用于ERG6及ERG11從而發(fā)揮抗真菌作用[8]。

2 外排泵相關耐藥基因

白念珠菌細胞膜上的外排泵活力增強是白念珠菌對唑類藥物耐藥的主要機制之一，主要有2類外排泵蛋白：擁有ATP結合盒結構（ATP-binding cassette，ABC）的轉(zhuǎn)運蛋白超家族和主要易化載體超家族（major facilitator superfamily，MFS）。

ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族依賴ATP水解的能量，具有廣泛的底物特異性，在預測的28種ABC轉(zhuǎn)運蛋白中，只有Cdr1p和Cdr2p與唑類藥物的耐藥相關，CDR1和CDR2基因的過表達使外排泵泵出藥物能力增強，從而導致白念珠菌對唑類藥物耐藥，此外，許多氟康唑耐藥株過表達CDR1和CDR2，其中1個或2個基因的缺失會導致分離株耐藥性下降[15-16]。CDR1和CDR2基因的過表達與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控有關，由TAC1基因編碼的CDR基因轉(zhuǎn)錄激活因子l（transcriptional activator ofCDRgene l，Tac1）介導CDR1和CDR2基因過表達，從而使外排泵活性增強導致耐藥。TAC1基因具有高度多態(tài)性，目前已發(fā)現(xiàn)19個GOF突變位點，隨著研究的深入，更多GOF突變將被證實。這些GOF突變都擁有促使外排泵活性增強的調(diào)控機制，從而導致白念珠菌產(chǎn)生耐藥[17-18]。

與ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族相比，MFS類具有較窄的底物特異性，依賴電化學質(zhì)子動力。在白念珠菌基因組預測的約95種MFS轉(zhuǎn)運蛋白中，只有Mdr1p與氟康唑耐藥相關；許多氟康唑耐藥株過表達MDR1，該基因的缺失會導致分離株耐藥性下降。Mdr1p表達由轉(zhuǎn)錄因子mrr1p調(diào)控，該因子點突變可誘導MDR1過表達，目前已發(fā)現(xiàn)15種不同GOF突變位點[6]。

3 潛在的耐藥相關基因

3.1 SRB1

SRB1編碼的甘露糖焦磷酸化酶（GDP-mannose pyrophosphorylase）是參與細胞壁甘露聚糖合成的關鍵催化酶，催化甘露糖-1-磷酸和GTP生成GDP甘露糖從而穩(wěn)定細胞形態(tài)，還可通過糖基修飾影響細胞整體功能。Warits等[19]對釀酒酵母SRB1進行了克隆及測序，這是對念珠菌SRB1首次系統(tǒng)性描述，該基因在調(diào)節(jié)白念珠菌細胞周期中發(fā)揮重要作用，且該基因在2種念珠菌的分子克隆水平具有同源性。隨后，Warits等[20]首先指出該編碼基因受啟動子CAMET3的調(diào)控，且編碼產(chǎn)物與白念珠菌細胞分離和/或胞質(zhì)分裂、出芽生長、菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)換等有關，并對多種抗真菌藥物和細胞壁抑制劑敏感，這表明casrb1可能是抗真菌藥物治療靶位。直到2008年，Warits等[21]發(fā)現(xiàn)新型隱球菌SRB1cDNA被克隆并證明能夠產(chǎn)生甘露糖焦磷酸化酶，因此推測該編碼基因可用于新的抗隱球菌化合物的篩選。高來強等[22]在最近的研究首次提出SRB1與白念珠菌氟康唑耐藥密切相關，然而，通過檢索文獻發(fā)現(xiàn)，對于白念珠菌SRB1在氟康唑敏感株與耐藥株的表達差異并無系統(tǒng)研究，因此，這對白念珠菌新耐藥機制的研究提供了新思 路。

3.2 CSC1

CSC1即VPS4/END13，編碼48 kDa的AAA-型ATP酶（AAA-type ATPases），參與細胞膜運輸，與內(nèi)吞作用等活動相關[23]。早期研究發(fā)現(xiàn)CSC1-1等位基因是在AAA-type ATPases家族中高度保守的CSC1開放閱讀框發(fā)生錯義突變，從而導致自噬，同時在野生型中不會引發(fā)自噬，提示CSC1開放閱讀框的獲得性功能突變與自噬相關，這為縮短葡萄酒發(fā)酵時間提供了新思路[24]。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，白念珠菌CaCSC1缺失株對酮康唑敏感，因此CSC1可能與白念珠菌酮康唑耐藥相關，且白念珠菌臨床耐藥株CaCSC1基因是否有高表達值得研究[25]。

3.3 凝集素樣序列（ALS）家族

早在1995年首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在2001年完成ALS家族中8個基因測序（ALS1-ALS7和ALS9）。大多數(shù)Alsp具有附著功能，特別是Als3p，能夠附著到內(nèi)皮細胞或者表皮細胞，在黏附宿主細胞、生物膜形成、入侵宿主細胞、鐵獲取等多個附著進程中發(fā)揮重要作用[26]。此外，調(diào)節(jié)ALS3的轉(zhuǎn)錄因子很多，包括Efg1p、Cph1p、Tec1p、Bcr1p、Nrg1p、Rfg1p和Tup1p等[26]。雖然已對白念珠菌ALS家族生物學方面進行了研究，且槲皮素已被證實能夠抵抗白念珠菌生物膜，從而對臨床陰道念珠菌病抗真菌藥提供思路，但我們?nèi)钥梢酝茰y，到目前為止仍存在未知的宿主細胞作用位點，這將有助于揭示白念珠菌附著、生物膜形成等機制，從而開發(fā)預防及治療白念珠菌病的藥物[27]。

3.4 耐藥相關ORF

眾所周知，白念珠菌的基因組包含28個ABC轉(zhuǎn)運蛋白，最常見的轉(zhuǎn)運蛋白由CDR基因家族編碼[28]。CDR1、CDR2與白念珠菌臨床株耐藥相關，而CDR3和CDR4具有磷脂翻轉(zhuǎn)酶功能[29]。開放閱讀框orf19.4531編碼一種ABC假定轉(zhuǎn)運蛋白，導致念珠菌對唑類藥物耐藥，而對2種多烯類抗真菌藥物（兩性霉素B和制霉菌素）以及麥角甾醇合成通路抑制劑無抵抗作用。開放閱讀框orf19.4531與液泡膜相關，轉(zhuǎn)錄因子Tac1可同步上調(diào)其與CDR1、CDR2，據(jù)報道該基因已在4株唑類耐藥株發(fā)揮作用[30]。開放閱讀框orf19.7119編碼TFIIH復合群中的一個組成部分Rad3解旋酶，在轉(zhuǎn)錄及核苷酸切除修復（nucleotide excision repair ，NER）中發(fā)揮重要作用，從而維持基因組的完整性及多樣性[31]。此外，白念珠菌開放閱讀框orf19.3727，與植酸酶活性、菌絲形成、上皮細胞黏附等相關，在真菌致病過程發(fā)揮關鍵作用，為研究抗真菌藥物提供了新思路[32]。

4 雜合性缺失（loss-of-heterozygosity，LOH）

LOH位于一對同源染色體上的相同基因座位2個等位基因中的1個（或其中部分核苷酸片段）發(fā)生缺失，與之配對的染色體上仍然存在。據(jù)報道，LOH與白念珠菌氟康唑耐藥具有相關性，高復發(fā)的LOH發(fā)生在白念珠菌3號染色體的右臂，5號染色體的左臂，其中，在3號染色體上，存在編碼外排泵的相關基因CDR1、CDR2及調(diào)節(jié)MDR1家族的轉(zhuǎn)錄因子Mrr1。5號染色體上存在編碼唑類藥物作用靶點的相關基因ERG11，此外，還有調(diào)節(jié)CDR1、CDR2表達的轉(zhuǎn)錄因子Tac1[33]?？梢?，LOH白念珠菌耐藥現(xiàn)象存在聯(lián)系，并再一次證明已知耐藥基因的作用。

5 適應性

Ford等[33]研究報道，無藥物存在時，MIC與適應性呈負相關，當有藥物存在時，與MIC一致，臨床菌株可表現(xiàn)出相對增強的適應性，表明在沒有選擇壓力（即不存在藥物）時，白念珠菌獲得性功能突變諸如MRR1、TAC1、UPC2等，與適應性降低有關。Ford等[33]找到了240個可能與適應性相關的多態(tài)性基因，并根據(jù)不同的功能分為5大集群：集群1富集細胞壁和細胞表面基因，集群2是與細胞周期和壓力有關的基因，集群3參與藥物反應的基因，集群5與碳水化合物結合有關。此外，ERG11某些特定位點的基因突變在引起唑類耐藥同時，也與適應性及酶的催化活性有關[34-35]。因此有必要進一步探討ERG11基因突變?nèi)绾斡绊懓啄钪榫倪m應性。

6 生物膜的形成

白念珠菌生物膜的形成經(jīng)過表面黏附、成絲、成熟、最終分散等一系列過程，可導致白念珠菌在體外藥物敏感試驗中敏感但體內(nèi)治療無效的結果。白念珠菌生物膜耐藥機制復雜，目前相關耐藥基因也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Nobile等[36]最早證實菌絲壁蛋白1（hyphal wall protein l，Hwp1）是白念珠菌體內(nèi)生物膜形成所必須的物質(zhì)，該基因的表達受到鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Bcr1的調(diào)控。黏附是白念珠菌生物膜形成的關鍵步驟，該過程有望揭示新的白念珠菌耐藥機制從而防止白念珠菌對人類健康造成威脅。有研究表明，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A（CsA）和FK506通過抑制白念珠菌生物膜的形成，并抑制其黏附、菌絲形成等相關基因的表達，降低細胞表面疏水性、增加細胞內(nèi)鈣濃度及藥物轉(zhuǎn)運，從而增強臨床上產(chǎn)生生物膜的白念珠菌對氟康唑的敏感性。該機制涉及的黏附相關基因ALS3、菌絲相關基因HWP1、ABC轉(zhuǎn)運蛋白耐藥基因CDR1和MDR1以及FLC靶向作用基因ERG11[37]。

綜上所述，白念珠菌唑類耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生并非由于單一機制的調(diào)控，而是多種機制引起，隨著時間的推移逐步產(chǎn)生高水平的耐藥性。隨著更多耐藥基因的發(fā)現(xiàn)與研究，眾多耐藥機制聯(lián)合起來可以讓我們更深刻地認識白念珠菌，同時有望找到新的藥物治療靶點。