文/何建新 江遠智 王順余 李 淵 陸圓圓 張 灝 杭 鋒＊

（1 浙江李子園食品股份有限公司；2 江南大學(xué)食品學(xué)院）

益生菌作為活的生物體[1，2]被應(yīng)用于各種食品中，可以提高食品本身的價值和抗腐敗能力，改善人體腸道微生物菌群，調(diào)節(jié)免疫原性反應(yīng)[3]，如谷物豆類發(fā)酵食品[4]、功能性寡糖[5]和發(fā)酵酸奶。牛奶是重要的益生菌載體[6]，因為牛奶含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、碳水化合物，可以為微生物提供豐富的碳源、氮源和一些微量元素，滿足大多數(shù)微生物的生長，還可以使微生物長時間存活，基本滿足世界上絕大部分人對益生菌的需求[7]。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，食品的發(fā)展不僅要求營養(yǎng)，而且還需要具備一定的功能[8]，因此，更多的益生菌被應(yīng)用到食品研發(fā)中。植物乳桿菌是人體腸道的常見微生物，除了少數(shù)幾株菌對酸和膽鹽比較敏感外，植物乳桿菌皆具有較強的耐酸和耐膽鹽能力[9，10]，可以與致病菌（如大腸桿菌）競爭[11]，降低致病菌在人體腸道的生長和繁殖能力，降低膽固醇水平[12]，具有吸附重金屬的作用[13]，同時，植物乳桿菌可以粘附在腸道黏膜表面[14]，作為活的生物體起作用。因此，以牛奶為載體，讓植物乳桿菌在其中生長，既可以作為牛奶的發(fā)酵劑，也能將植物乳桿菌的功能植入到牛奶中，還可以保持單位體積的高活菌數(shù)，而且容易被人們所接受。

植物乳桿菌屬于營養(yǎng)缺陷型細菌，自身不能合成多種氨基酸和嘌呤[15]，同時，植物乳桿菌缺乏胞外蛋白酶基因[16]，不能合成蛋白質(zhì)水解酶[17]，不能有效將牛奶中的乳蛋白分解成多肽和氨基酸而用于植物乳桿菌的生長和繁殖。因此，僅靠牛奶中的營養(yǎng)成分不能滿足植物乳桿菌的代謝和繁殖，導(dǎo)致牛奶難以凝乳和單位毫升內(nèi)活菌數(shù)難以提高，需要尋找可以促進植物乳桿菌在牛奶中生長的增殖劑，使得植物乳桿菌可以在牛奶中快速增殖。果蔬汁中含豐富的氨基酸、維生素和生物活性物質(zhì)，不僅能夠促進植物乳桿菌的生長[18]，還可以作為植物乳桿菌的載體[19]，同時，植物乳桿菌CCFM 8661是從泡菜中分離得到的，因此，果蔬汁中含有植物乳桿菌生長和繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 菌種

植物乳桿菌CCFM 8661，江南大學(xué)于2007年從中國傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離獲得，菌種保藏編號為CGMCC NO.5494，菌粉由江蘇省微康生物科技有限公司生產(chǎn)（活菌數(shù)為3.8×1011CFU/g）；YO-MIX M11商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌），杜邦丹尼斯克公司生產(chǎn)。

1.2 材料與試劑

材料：菠蘿、黃瓜、獼猴桃、豆?jié){、玉米、番茄、胡蘿卜（揚州廣陵區(qū)大潤發(fā)超市）；天然乳清（上海仟爵生物科技有限公司）；低脂果膠（上海藍安實業(yè)有限公司）；玉米淀粉NOVATION 2300（宜安瑞中國有限公司）；蔗糖［一級，上海糖業(yè)煙酒（集團）有限公司］；香蕉漿（DOHLER）；全脂奶粉（徐州凱舜乳業(yè)有限公司）。

試劑：酚酞（98%，博飛美科）；瓊脂粉、魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，均為生化試劑，氫氧化鈉、無水磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、無水乙酸鈉、葡萄糖、無水乙醇、氯化鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、L（+）-抗壞血酸，均為分析純，吐溫80，化學(xué)純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甘油磷酸鈉、胰蛋白胨（生工生物工程股份有限公司）；大豆蛋白胨（博試生有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

堿式滴定管；培養(yǎng)箱BSP-150（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超純水機VE-60CH-AI（深圳市宏森環(huán)?？萍加邢薰荆?；立式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-70A（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超凈臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；實驗室pH計ST3100［奧豪斯儀器（常州）有限公司］；榨汁機HS-200（中山市海尚電器有限公司）。

1.4 酸奶制作流程

1.4.1 原料前處理

將菠蘿、黃瓜、獼猴桃、玉米、番茄、胡蘿卜用清水洗凈，榨汁機打漿，4 層紗布過濾，收集濾液即為果蔬汁增殖劑。菠蘿汁、黃瓜汁、獼猴桃汁均在95 ℃條件下滅酶15 min，-40 ℃貯存?zhèn)溆?。?fù)合果蔬汁的組合原則是較高pH值和較低pH值的果蔬汁進行混合，牛奶初始pH值低會影響其穩(wěn)定性。復(fù)合果蔬汁分別為黃瓜汁-獼猴桃汁（1∶1）、菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）、豆?jié){汁-玉米汁（1∶1）、番茄汁-胡蘿卜汁（1∶1），pH值分別為4.24、4.25、5.60、4.70，添加量為7.5%，添加復(fù)合果蔬汁后的牛奶pH值分別為6.52、6.36、6.57、6.54。

1.4.2 發(fā)酵乳工藝

將90 g奶粉與500 g水混合，攪拌均勻，置于4 ℃冰箱中；將70 g糖溶解在260 g水中，常溫下加入1.5 g低脂果膠和2 g天然乳清，攪拌均勻，然后將兩者加熱至55 ℃后互混，繼續(xù)攪拌均勻，加入自來水使總質(zhì)量為1 000 g，即為發(fā)酵乳基料。向發(fā)酵乳基料中緩慢添加4 種復(fù)合果蔬汁，添加量為7.5%；同時，為了進一步考察香蕉漿和菠蘿汁對植物乳桿菌CCFM 8661的增殖作用，分別單獨添加香蕉漿和菠蘿汁，添加量分別為5%、7.5%、10%，上述即為含果蔬汁的發(fā)酵乳基料。

將60 g發(fā)酵乳基料和含果蔬汁的發(fā)酵乳基料置于100 mL奶瓶中，放入滅菌鍋內(nèi)，108 ℃條件下滅菌15 min，滅菌結(jié)束后冷卻至室溫，接種發(fā)酵劑，其中植物乳桿菌CCFM8661的接種量為2.5×107CFU/mL，商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）的接種量為6.0×106CFU/mL。添加果蔬汁的發(fā)酵乳基料接種植物乳桿菌CCFM8661，發(fā)酵乳基料接種植物乳桿菌CCFM8661作為空白對照，接種商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）和植物乳桿菌CCFM8661進行協(xié)同發(fā)酵試驗。

1.5 檢測方法

協(xié)同發(fā)酵試驗在發(fā)酵0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h時取樣，其余試驗在發(fā)酵0 h、24 h、48 h時取樣。

發(fā)酵乳樣品的pH值使用pH計直接測定；滴定酸度參照《食品安全國家標準 食品酸度的測定》（GB 5009.239-2016）；活菌數(shù)采用稀釋梯度平板計數(shù)法，超凈臺上用無菌移液槍取5 mL樣品于滅菌的牛奶瓶中，加入45 mL生理鹽水，依次稀釋10 倍，一直稀釋到10-7梯度，取稀釋梯度10-5、10-6、10-7各1 mL于培養(yǎng)皿中，其中以植物乳桿菌CCFM8661作為發(fā)酵劑的樣品使用MRS培養(yǎng)基計數(shù)，以商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）和植物乳桿菌CCFM8661共同作為發(fā)酵劑的樣品分別使用M17培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基計數(shù)。

圖1 溫度對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

圖2 空白對照組和添加4 種復(fù)合果蔬汁樣品組發(fā)酵過程的pH值變化

2 結(jié)果分析

2.1 溫度對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

為研究不同溫度條件下植物乳桿菌CCFM8661的增殖情況，在32℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃條件下發(fā)酵24 h，測定空白對照組和添加4 種復(fù)合果蔬汁樣品組的活菌數(shù)，結(jié)果見圖1。在不添加4 種復(fù)合果蔬汁情況下，發(fā)酵24 h時，活菌數(shù)未發(fā)生明顯增加，總體差異不大。在添加4 種復(fù)合果蔬汁情況下，菠蘿汁-香蕉漿樣品組促進增殖作用最好，32 ℃、35 ℃、37 ℃、40℃條件下發(fā)酵24 h后的活菌數(shù)分別為4.7×108CFU/mL、1.4×109CFU/mL、1.21×109CFU/mL、5.7×108CFU/mL，說明植物乳桿菌CCFM8661在32 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃均可生長，35 ℃、37℃比32 ℃、40 ℃更利于植物乳桿菌CCFM8661的生長，35 ℃為最適生長溫度。

2.2 滴定酸度和pH值

由圖3可知，滴定酸度與活菌數(shù)變化基本一致，菠蘿汁-香蕉漿樣品組在發(fā)酵24 h時的滴定酸度和活菌數(shù)最高，分別為100°T和1.4×109CFU/mL；發(fā)酵24 h后，植物乳桿菌CCFM8661的生長進入穩(wěn)定期，后續(xù)發(fā)酵對活菌數(shù)影響不大，滴定酸度的增加也不顯著，發(fā)酵48 h時滴定酸度為111°T，僅上升了11°T。

酸是植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物，發(fā)酵乳的滴定酸度和pH值可以作為活菌數(shù)的表征，也可以作為發(fā)酵乳的理化參數(shù)，空白對照組和添加4種復(fù)合果蔬汁樣品組發(fā)酵過程的pH值變化如圖2所示，滴定酸度和活菌數(shù)變化見圖3。

由圖2可知，發(fā)酵時間越長，pH值越低；發(fā)酵24 h時，樣品組的pH值比空白對照組低，pH最低的是菠蘿汁-香蕉漿樣品組，為3.8，pH最高的是番茄汁-胡蘿卜汁樣品組，為5.35；發(fā)酵24 h后，菠蘿汁-香蕉漿樣品組繼續(xù)發(fā)酵的pH值下降不明顯，至48 h時pH值僅下降0.03。

2.3 復(fù)合果蔬汁對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

發(fā)酵溫度為35 ℃，空白對照組和添加4 種復(fù)合果蔬汁樣品組在0 h、24 h、48 h時的活菌數(shù)見圖4。植物乳桿菌CCFM8661接種量為2.5×107CFU/mL，發(fā)酵24 h后，空白對照組的活菌數(shù)依然無法達到1.0×108CFU/mL；樣品組發(fā)酵24 h后的活菌數(shù)全部可以達到1.0×108CFU/mL，促進生長作用最好的是菠蘿汁-香蕉漿樣品組，活菌數(shù)最高可以達到1.4×109CFU/mL，促進生長作用最差的是番茄汁-胡蘿卜汁樣品組，活菌數(shù)僅能達到1.49×108CFU/mL；發(fā)酵24 h后，后續(xù)發(fā)酵并沒有使活菌數(shù)上升，說明24 h后的發(fā)酵液不適合植物乳桿菌CCFM8661繼續(xù)增殖，可以將24 h作為發(fā)酵終點。

圖3 空白對照組和添加4 種復(fù)合果蔬汁樣品組發(fā)酵過程的滴定酸度和活菌數(shù)變化

圖4 復(fù)合果蔬汁對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

2.4 菠蘿汁和香蕉漿對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

菠蘿汁、香蕉漿、菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）樣品組在35 ℃條件下發(fā)酵0 h、24 h、48 h后的酸度和活菌數(shù)見圖5。單獨添加香蕉漿對促進植物乳桿菌CCFM8661增殖的效果不好，最高活菌數(shù)僅能到達1.39×108CFU/mL，最高滴定酸度為55 °T，發(fā)酵乳未發(fā)生凝乳；單獨添加菠蘿汁對促進植物乳桿菌CCFM8661增殖的效果很好，添加量越大，活菌數(shù)和滴定酸度越高，在發(fā)酵24 h時，菠蘿汁添加量為5%、7.5%、10%樣品組的活菌數(shù)分別為1.54×109CFU/mL、1.69×109CFU/mL、1.85×109CFU/mL，滴定酸度分別為110°T、112°T、127°T。將5%菠蘿汁添加到牛奶中，108 ℃滅菌15 min后，出現(xiàn)水相層，且添加量越高，水相層越厚。分別添加5%香蕉漿和5%菠蘿汁的發(fā)酵乳基料的初始pH值為6.54和6.28，說明初始pH值低會影響體系穩(wěn)定性，加入香蕉漿可以改善體系的初始pH值，添加量為7.5%的菠蘿汁-香蕉漿體系穩(wěn)定性相對較好。

2.5 協(xié)同發(fā)酵試驗

植物乳桿菌缺乏蛋白質(zhì)水解酶，不能水解牛奶中的乳蛋白，因此牛奶不能滿足植物乳桿菌對生長和繁殖的營養(yǎng)需求。商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）可以水解牛奶中的乳蛋白[20]，本文將植物乳桿菌CCFM8661和商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）同時接種到牛奶中，探究植物乳桿菌CCFM8661能否利用商業(yè)酸奶發(fā)酵劑的代謝產(chǎn)物增殖?？瞻讓φ战M和協(xié)同發(fā)酵樣品組在35 ℃條件下發(fā)酵0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h后的滴定酸度與活菌數(shù)見圖6，協(xié)同發(fā)酵樣品組和菠蘿汁-香蕉漿樣品組在35 ℃條件下發(fā)酵0 h、24 h、48 h后的活菌數(shù)見圖7。

由圖6可知，協(xié)同發(fā)酵使植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵液中的活菌數(shù)明顯升高，發(fā)酵24 h時的活菌數(shù)可達到3.3×108CFU/mL，比植物乳桿菌CCFM8661單獨發(fā)酵效果好；前6 h的發(fā)酵過程中，植物乳桿菌CCFM8661生長緩慢，活菌數(shù)只有9.5×107CFU/mL，但總活菌數(shù)達到5.4×108CFU/mL，商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）生長迅速；6 h后的發(fā)酵過程中，總活菌數(shù)的增加以植物乳桿菌CCFM8661為主，發(fā)酵48 h時，植物乳桿菌CCFM8661活菌數(shù)達到4.2×108CFU/mL，說明商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）的代謝產(chǎn)物可以被植物乳桿菌CCFM8661利用，可能是商業(yè)酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）將乳蛋白分解成多肽和氨基酸，進而被植物乳桿菌CCFM8661利用。

圖5 菠蘿汁和香蕉漿對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

由圖7可知，協(xié)同發(fā)酵可以使植物乳桿菌CCFM8661在牛奶中增殖，但促進作用不如添加復(fù)合菠蘿汁-香蕉漿好。添加復(fù)合菠蘿汁-香蕉漿可以使牛奶中的植物乳桿菌CCFM8661活菌數(shù)上升2 個數(shù)量級，而協(xié)同發(fā)酵只能使牛奶中植物乳桿菌CCFM8661活菌數(shù)升高1 個數(shù)量級，但協(xié)同發(fā)酵總活菌數(shù)可以達到9.8×108CFU/mL，也可以作為新型酸奶的發(fā)酵劑。

3 討論與分析

植物乳桿菌屬于乳酸菌屬，產(chǎn)酸能力比較強，而且具有較強耐酸、耐膽鹽能力[9，10]，黏附在腸道黏膜表面的能力較強[14]，人體腸道植物乳桿菌增多，則腸道表面黏附致病菌減少，不能黏附在腸道表面的致病菌會隨著糞便排出，降低了致病菌在腸道中長時間停留的危害，因此，植物乳桿菌具有益生特性。

圖6 空白對照組和協(xié)同發(fā)酵樣品組發(fā)酵過程的滴定酸度和活菌數(shù)

細菌在生長繁殖過程中不可避免地涉及到多種酶，酶在轉(zhuǎn)運和代謝過程中起著關(guān)鍵作用，如果酶的活性受到影響，將嚴重影響細菌的生長和代謝。溫度與酶的活性息息相關(guān)，在最適溫度條件下，酶的活性最高，合成細菌生長和繁殖的必需氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)的速度也最快，因此，活菌數(shù)最高。本文研究結(jié)果表明，35 ℃最適合植物乳桿菌CCFM8661的生長。

圖7 協(xié)同發(fā)酵樣品組和菠蘿汁-香蕉漿樣品組發(fā)酵過程的活菌數(shù)

國內(nèi)外研究者通過添加氨基酸、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素和果蔬汁等增殖劑，促進植物乳桿菌在牛奶中增殖。Ma等[15]通過試驗證明了異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和核苷酸前體物質(zhì)是植物乳桿菌在牛奶中增殖的必需成分。類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵上清液[21]、酵母提取物、酪蛋白酶解物、蛋白胨[17]作為增殖劑，可以促進植物乳桿菌生長，而且可以使酸奶凝乳，說明植物乳桿菌利用乳蛋白能力較弱，通過添加被植物乳桿菌吸收利用的氮源，可以促進植物乳桿菌在牛奶中增殖。Yang等[18]研究表明，添加10%黑莓汁可以使植物乳桿菌在牛奶中的活菌數(shù)達到1×1010CFU/mL。本文試驗結(jié)果表明，果蔬汁含有可以被植物乳桿菌利用的氮源，能夠促進植物乳桿菌在牛奶中增殖，菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）效果最好。

一種菌的代謝產(chǎn)物可以作為另一種菌的原料，同時，多種菌同時作為發(fā)酵劑，可以產(chǎn)生更多的生物活性物質(zhì)[22，23]，加強機體的免疫能力。通過協(xié)同發(fā)酵使植物乳桿菌在牛奶中生長也是一種比較廉價的方式，具有較大的商業(yè)價值[24]。本文試驗結(jié)果表明，協(xié)同發(fā)酵使植物乳桿菌CCFM8661活菌數(shù)升高了50倍，總活菌數(shù)比普通酸奶的活菌數(shù)要高，作為復(fù)合型酸奶的新品，也可以投入市場。

4 結(jié)論

通過空白對照組與添加果蔬汁樣品組的對比試驗，添加果蔬汁可以明顯改善植物乳桿菌CCFM8661在牛奶中的增殖，菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）效果最好，活菌數(shù)可達1.4×109CFU/mL，而且酸奶穩(wěn)定性及風(fēng)味比較好；菠蘿汁添加量高，則活菌數(shù)高，但體系穩(wěn)定性不好；協(xié)同發(fā)酵可以使植物乳桿菌CCFM8661活菌數(shù)達到4.2×108CFU/mL，但總活菌數(shù)不高。因此，以菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）作為植物乳桿菌CCFM8661在牛奶中的增殖劑，35 ℃條件下發(fā)酵24 h效果最佳。