施 虹， 任大斌， 鄭 平， 童武松， 馮九庚， 段 劍， 陳 偉

腦缺血再灌注損傷(I/R)所帶來(lái)的致死及致殘率仍然較高[1]，目前臨床上缺乏明確有效的治療手段。人參皂甙(GS)是人參中最主要的活性物質(zhì)，已經(jīng)被證明對(duì)神經(jīng)損傷類(lèi)疾病有著明顯的保護(hù)作用[2]。GS-Rb1已被證明是GS中最主要的成份。我們的前期研究顯示：GS-Rb1的腦保護(hù)作用可能和下調(diào)縫隙連接蛋白(Connexin，Cx)40有關(guān)[3]，但尚未進(jìn)一步證明相關(guān)的分子機(jī)制。本研究通過(guò)缺血再灌注損傷后調(diào)控PKA途徑，觀察PKA途徑參與GS-Rb1下調(diào)Cx40表達(dá)的相關(guān)性，旨在探討GS-Rb1對(duì)腦I/R損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制及可能涉及多信號(hào)分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑，為腦缺再灌注損傷的分子水平的治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 100只3月齡、體重350～450 g的雄性SD大鼠購(gòu)置于上海畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(滬ICP備05033115)苯巴比妥麻醉鈉購(gòu)置Fluka公司(德國(guó))。GS-Rb1(純度大于99%)購(gòu)自上海邦景(中國(guó))，H-89(純度大于99%)購(gòu)自上海RBI生物(中國(guó))，兔抗大鼠Cx40一抗購(gòu)自Santa Cruz(美國(guó))，兔抗大鼠GAPDH一抗購(gòu)自Abcam(英國(guó))，辣根酶標(biāo)記二抗均購(gòu)自Abcam (英國(guó))，化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自中山金橋生物科技(中國(guó))，所有ELFA、ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物(中國(guó))，激光多普勒血流儀購(gòu)自Stockholm(瑞典)，蛋白電泳儀購(gòu)自Bio-Rad(美國(guó))，NAPDH氧化酶活性試劑盒購(gòu)自Beyotime (中國(guó))，M200Pro免疫酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN(奧地利)。

1.2 動(dòng)物模型制作 實(shí)驗(yàn)用大鼠在通風(fēng)房間內(nèi)按照光照：黑暗時(shí)間比例為12∶12 h，給予水和食物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，動(dòng)物倫理已得到上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的同意。按照夾閉法建立大鼠缺血模型：將3%戊巴比妥以65 mg/kg的濃度給予大鼠麻醉后，以頸部正中切口進(jìn)入，找到雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分離血管外膜及迷走神經(jīng)，用微血管夾將雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉，整個(gè)手術(shù)過(guò)程用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用體溫裝置把動(dòng)物體溫維持的37 ℃攝氏度。夾閉效果用激光多普勒血流儀進(jìn)行測(cè)量(以小于正常血流量的25%作為有效)。阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流30 min后，撤去血管夾，恢復(fù)血流，產(chǎn)生再灌注(以血流量恢復(fù)至基線(xiàn)水平75%視為有效)。

1.3 藥物的干預(yù)及分組 100只SD大鼠被隨機(jī)分為①假手術(shù)(sham)組、②灌注后GS-Rb1(I/R+GS-Rb1)治療組、③灌注后GS-Rb+H-89阻斷(I/R+GS-Rb1+H-89)組、④溶媒(I/R+DMSO)組及⑤損傷(I/R)組，每組20只。①僅暴露而不夾閉頸總動(dòng)脈，②③均采用夾閉頸總動(dòng)脈法制作腦I/R模型，1 h后腹腔注射GS-Rb1及GS-Rb1+H-89，④為I/R形成1 h后腹腔注射DMSO，而⑤則是I/R形成后不給予處理，所有組實(shí)驗(yàn)時(shí)間均設(shè)定為I/R后8 h。每組取10動(dòng)物行行為學(xué)檢測(cè)和腦組織含水量測(cè)定，另10只動(dòng)物則行蛋白學(xué)檢測(cè)。根據(jù)我們之前預(yù)實(shí)驗(yàn)及前期實(shí)驗(yàn)顯示，為獲得P值在0.05水平，1-beta在0.20水平，根據(jù)Effect-Size計(jì)算出所需要的每組動(dòng)物數(shù)量為8(G-Power3.0)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們預(yù)定每組10只動(dòng)物，以防動(dòng)物意外死亡引起樣本量的不足。根據(jù)腦缺血再灌注損傷的病理生理特點(diǎn)及我們前期的研究經(jīng)驗(yàn)，設(shè)定在再灌注后8 h，以拉頸法處死動(dòng)物。

1.4 大鼠NSS評(píng)分 采用雙盲法，根據(jù)以下原則：(1)提鼠尾離地面約1尺，觀察前肢情況。正常大鼠兩前肢對(duì)稱(chēng)地伸向地面。有左肩內(nèi)旋，左前肢內(nèi)收者，評(píng)為4分，否則0分。(2)將動(dòng)物置平滑地板上，分別推左(或右)肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢查抵抗運(yùn)動(dòng)的阻力。正常大鼠兩側(cè)阻力明顯對(duì)稱(chēng)。右肩向左側(cè)移動(dòng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)阻力下降時(shí)，根據(jù)下降程度的不同，評(píng)為1～3分；(3)將動(dòng)物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的張力，正常大鼠兩前肢的張力明顯對(duì)稱(chēng)，發(fā)現(xiàn)左前肢肌張力下降者，根據(jù)下降的輕重，評(píng)為0～3分。根據(jù)以上評(píng)分，滿(mǎn)分10分，分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。

1.5 腦含水量測(cè)定 我們采用Hatashita的干濕重法測(cè)定腦含水量的變化。將完成NSS的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，快速開(kāi)顱取出大腦，并移到冰面，并測(cè)定大腦的濕重。再將動(dòng)物大腦放入蒸箱中，在110 ℃，烘蒸24 h，測(cè)得大腦干重的量。含水率為(濕重大腦-干重大腦)/濕重大腦*100%。

1.6 免疫蛋白印記(WB)實(shí)驗(yàn) 將海馬區(qū)域的皮質(zhì)組織標(biāo)本收集，并置入試管中，用冰冷的PBS洗滌兩次；加入RIPA裂解緩沖液(Santa Cruze)，含1%的蛋白酶抑制劑混合物。冰上勻漿、裂解10 min，低溫離心12000 r/min，15 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg總蛋白，經(jīng)12%的SDS-PAGE Gel電泳分離，常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜上，5%脫脂牛奶-TBST封閉2 h，再分別將Cx40(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)一抗加入封閉液，4攝氏度輕搖過(guò)夜，回收一抗液體，給予TBST溶液洗滌NC膜，加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗抗體與封閉液按1∶2000的比例混合液，37 ℃，孵育1 h，再采用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光顯影。采用Image J 1.36b軟件下行吸光度分析，蛋白吸光度值/GAPDH為相對(duì)含量，以Sham組目標(biāo)蛋白/GAPDH為100%，其余組與之進(jìn)行比較。

1.7 ELFA檢測(cè)氧化應(yīng)激因子NAPDH氧化酶活性 自腦分離出海馬的皮質(zhì)組織，在冰上PBS中充分勻漿，以4 ℃，12000 r/min，10 min離心，取上清液，置入96孔熒光板中，再加入80 μlPBS及6.25 μl的1 mol/L的光澤精，再加入100 μmol/L的NAPDH后開(kāi)始發(fā)生反應(yīng)。采用多功能酶標(biāo)儀，在吸收波長(zhǎng)340 nm，檢測(cè)速度30 s，時(shí)間為5 min。

1.8 ELISA法炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的測(cè)定 采用第1.7部分的標(biāo)本，按照炎性因子各自的ELISA免疫試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)損傷嚴(yán)重度評(píng)分(Neurological Severity Score，NSS) GS-Rb1治療組盡管較假手術(shù)組0分明顯升高(P<0.05)，但相對(duì)于溶媒組及損傷組卻明顯降低(P<0.05)，具有治療效應(yīng)。采用H-89后，此種效應(yīng)可被明顯抑制(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

2.2 腦含水量的測(cè)定 腦水腫含量測(cè)定結(jié)果表明，GS-Rb1治療后，腦水腫程度較溶媒組及損傷組明顯緩解(P<0.05)，且與假手術(shù)組無(wú)明顯差異(P>0.05)。但H-89可明顯降低GS-Rb1的此種腦保護(hù)效應(yīng)(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

2.3 蛋白學(xué)檢測(cè)Cx40在GS-Rb1及GS-Rb1+H-89單獨(dú)及聯(lián)合作用下表達(dá)的變化 在給予GS-Rb1治療后，Cx40蛋白表達(dá)盡管較假手術(shù)組升高，但較溶媒組及損傷組明確下降，而H-89則可明顯抑制GS-Rb1的此種效應(yīng)(見(jiàn)圖3)。

2.4 氧化應(yīng)激因子NAPDH氧化酶(NAPDH oxidase activity)活性測(cè)定 GS-Rb1可明顯下調(diào)損傷后神經(jīng)元NAPDH氧化酶的活性(P<0.05)，且與假手術(shù)組相比亦無(wú)明顯差異(P>0.05)，但是此種效應(yīng)可被H-89明顯的抑制(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

2.5 ELISA檢測(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元氧化應(yīng)激因子炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-a等炎性因子蛋白的表達(dá) GS-Rb1治療組較阻斷組可明顯降低IL-1β、IL-6及TNF-a表達(dá)(P<0.05)，但給予H-89后，則可明顯抑制GS-Rb1的此種效應(yīng)(P<0.05)(與假手術(shù)組比較*P<0.05；與GS-Rb1保護(hù)組比較#P<0.05)(見(jiàn)圖5)。

各實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)(Sham)組比較*P<0.05，I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較#P<0.05

圖1 NSS評(píng)分的變化(n=10)

各實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)(Sham)組比較*P<0.05，I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較#P<0.05

圖2 腦含水量的變化(n=10)

各實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)(Sham)組比較*P<0.05，# I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較P<0.05

圖3 Cx40相對(duì)含量的表達(dá)(n=10)

各實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)(Sham)組比較*P<0.05，# I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較P<0.05

圖4 NAPDH oxidase activity的變化(n=10)

A. IL-1β；B. IL-6；C. TNF-α各實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)(Sham)組比較*P<0.05，# I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較P<0.05

圖5 炎性因子的含量的變化(n=10)

3 討 論

人參已經(jīng)被廣泛的作為藥物、保健及飲食之用。人參皂甙(GS)已被證明是人參的最主要的活性成分。目前大量實(shí)驗(yàn)證明：GS具有抗炎、抗氧化及降低脂質(zhì)類(lèi)代謝產(chǎn)物的作用[4]。Rb1作為GS中含量最為主要的成分，得到越來(lái)越多的重視。目前已證實(shí)GS-Rb1能維持腦血屏障的完整，在腦缺血后治療中起著明顯腦保護(hù)作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：GS-Rb1可抑制氧化應(yīng)激因子NOX1、NOX2、NOX4、NAPDH及炎癥因子IL-1β，并上調(diào)細(xì)胞骨架蛋白ZO-1、Occludin的表達(dá)，具有神經(jīng)功能保護(hù)作用[5]。但以上的研究尚未對(duì)GS-Rb1參與調(diào)節(jié)的損傷因子的具體方式和機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分析，因此我們?cè)诒卷?xiàng)實(shí)驗(yàn)中，我們采用信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，來(lái)進(jìn)一步觀察GS-Rb1對(duì)上述產(chǎn)物的具體作用機(jī)制。

縫隙連接(Gap Junction，GJ)為細(xì)胞間的直接聯(lián)系的方式。GJ可供細(xì)胞內(nèi)的離子、某些小分子信號(hào)傳導(dǎo)因子及細(xì)胞內(nèi)容物(<1.2KD)在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞[6]。GJ在腦損傷的過(guò)程中起著重要的作用，不同類(lèi)型的GJ對(duì)損傷/抗損傷信號(hào)具有選擇性，但相關(guān)機(jī)制仍未完全清楚[7]。目前大量研究認(rèn)為，Cx43和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、Na-Ka-ATP酶、熱休克蛋白相關(guān)性密切，可加強(qiáng)腦損傷性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，并減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物的產(chǎn)生[8，9]，Cx43還可與Bcl2結(jié)合，緩解細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[10]。針對(duì)于Cx40蛋白與腦損傷的相關(guān)性，來(lái)自于動(dòng)物模型及臨床標(biāo)本的研究均顯示：腦損傷后Cx40蛋白含量的升高及Cx40與Cx43形成的異型縫隙連接的升高增多與腦損傷程度呈現(xiàn)一致性[11，12]。我們的前期研究還證實(shí)，Cx40的增多可能與氧化應(yīng)激活性的增強(qiáng)密切相關(guān)[3]。此外，近年來(lái)的研究顯示Cx40與IkBa具有同源性，其異常升高可能與核因子途徑的激活相關(guān)[13]。因此，我們推測(cè)，Cx40蛋白的異常增多可能是Cx43功能的喪失的一種補(bǔ)償機(jī)制，且異常表達(dá)Cx40對(duì)損傷/抗損傷物質(zhì)的通過(guò)性平衡失調(diào)，導(dǎo)致?lián)p傷信號(hào)的擴(kuò)大、氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)及核因子途徑活化所致的炎性因子的大量增生，具有腦損傷的效應(yīng)。同時(shí)在我們對(duì)上游的信號(hào)途徑的篩選研究中發(fā)現(xiàn)，ERK1/2通路與Cx40異常增多及Cx43磷酸化的相關(guān)性最大，且通過(guò)抑制ERK1/2通路，可明顯緩解腦損傷的程度[11]。有文獻(xiàn)指出，在多條不同功能信號(hào)傳導(dǎo)通路中存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制的Gatekeeper[14]效應(yīng)，而PKA途徑可上調(diào)Cx43的功能，從而被稱(chēng)為Cx43功能的Gatekeeper。因此我們推測(cè)，腦損傷后ERK1/2途徑的激活可抑制PKA途徑的活性，導(dǎo)致Cx40蛋白異常增多及Cx43蛋白磷酸化升高及縫隙連接功能紊亂可能與腦損傷密切相關(guān)。

結(jié)合上述的情況，我們認(rèn)為GS-Rb1腦保護(hù)效應(yīng)可能與PKA途徑的激活、通過(guò)Gatekeeper效應(yīng)抑制ERK1/2途徑的活性從而進(jìn)一步抑制Cx40升高有關(guān)。在我們的此項(xiàng)試驗(yàn)中，我們采用PKA的特異性抑制劑H-89，觀察其如何影響GS-Rb1在腦損傷后的治療效應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)，H-89能明顯抑制GS-Rb1下調(diào)Cx40的功能，同時(shí)能抑制GS-Rb1降低氧化應(yīng)激因子及炎性因子等腦保護(hù)作用，并且這些作用均在形態(tài)學(xué)及行為學(xué)上得到了進(jìn)一步的證實(shí)。

綜上所述，我們的此項(xiàng)研究結(jié)果進(jìn)一步明確GS-Rb1參與損傷后腦保護(hù)機(jī)制與抑制Cx40蛋白表達(dá)異常升高有著密切的關(guān)系，同時(shí)也明確了PKA途徑可能參與了這個(gè)過(guò)程，從而以期為進(jìn)一步研究腦缺血再灌注損傷可能的基因靶點(diǎn)治療奠定基礎(chǔ)。