劉月榮，陳曦，田野

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胞外囊泡對血管生成影響的研究進展

劉月榮，陳曦，田野

150001 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內科

胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由不同細胞產生并釋放到細胞外的囊泡。最初被認為是無生物學功能的細胞碎片，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)其在血管生成、免疫調節(jié)、組織修復等過程中發(fā)揮重要作用。EVs 攜帶了許多表面受體、遺傳物質、生物活性分子等，在細胞間傳遞信息，從而在血管生成過程中發(fā)揮了重要作用。本文就 EVs 對血管生成影響的研究進展綜述如下。

1 胞外囊泡的產生和生物學特性

EVs 是指在正常和應激狀態(tài)下由不同細胞產生的脂質雙分子層包繞的球囊狀結構[1]。根據(jù)其大小和生成途徑，EVs 可分為 3 種主要類型：外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體的直徑在 30 ~ 120 nm 之間，微泡直徑在 100 ~ 1000 nm 之間，凋亡小體直徑在 800 ~ 5000 nm 之間。外泌體是由細胞膜與胞體內陷形成的多泡體融合釋放而成，微泡則直接由細胞膜出芽生成，凋亡小體是由 caspase 介導的程序性死亡細胞出泡形成的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，某些特異蛋白在 EVs 的生成和釋放中發(fā)揮重要的作用，如四跨膜蛋白家族分子（CD81、CD9 和 CD63）、熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP90）、轉運必需內體分選復合物（Tsg101、Alix）、參與膜融合的蛋白質（Rabs、ARF6）和信號蛋白等[3-4]。此外，這些過去被認為是外泌體特異性的蛋白也可以在微泡中被檢測出。所有 EVs 亞群體中的蛋白質分布不均勻[5-6]。不同的細胞產生的 EVs 往往帶有其細胞膜上的特異性受體。而 EVs 膜脂質組成及分布與母細胞不相同[3]。EVs 的質膜富含磷脂酰絲氨酸、糖鞘脂、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和膽固醇。而在 EVs 上表達的磷脂酰絲氨酸是其特征之一。除表面分子外，EVs 中還含有可溶性因子，如細胞因子、生長因子和轉錄因子[3]。除了蛋白質和脂類，EVs 還可以整合遺傳物質，例如小而長的編碼和非編碼的 RNA（mRNA、miRNA 和 IncRNA），以及其他細胞質成分和分子。

2 EVs 與血管生成

血管生成是指在已經(jīng)存在的血管網(wǎng)絡中形成新的血管的過程，存在于有機體的生長和發(fā)育中。血管生成有以下兩種方式：一種是出芽式血管生成，經(jīng)過血管基底膜降解，內皮細胞（endothelial cells，ECs）的增殖、遷移、發(fā)芽、分枝，形成新血管；另一種是套疊式血管生成，通過間質組織侵入現(xiàn)有血管，形成跨血管組織柱，隨后血管擴張和分裂形成新血管。新血管結構的穩(wěn)定和成熟需要周細胞的聚集、細胞外基質的沉積和剪切應力的機械刺激[2]。在健康的組織中，血管生成被促血管生成信號和抗血管生成信號精確平衡地調控。當這種平衡受到干擾時，就會出現(xiàn)血管生成異常，這是許多疾病進展的主要原因，如癌癥、動脈粥樣硬化、角膜新生血管、類風濕關節(jié)炎和缺血性疾病等。因此，EVs 在血管形成過程中發(fā)揮重要的作用（表 1）。

2.1 EVs 促血管生成的作用機制

EVs 可通過向 ECs 傳遞促血管生成的 miRNA 發(fā)揮促血管生成作用。ECs 源性的外泌體中的 miR-214通過抑制其他內皮細胞 ATM 的表達，在體外和體內發(fā)揮促血管生成作用[7]。經(jīng)過 IL-3 刺激的 EC 產生的 EVs 通過將 miR-126-3p 轉移到受體 EC，導致 Spred-1 降低，ERK1/2 激活，從而促進血管生成[8]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，內皮細胞凋亡小體中的 miR-126 可以通過誘導動脈粥樣硬化小鼠靶細胞中 CXCL 12 的表達和內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPC）的募集發(fā)揮促血管生成的作用，并增加斑塊穩(wěn)定性而產生抗動脈粥樣硬化作用[9]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，內皮克隆形成細胞（endothelial colony-forming cells，ECFC）的EVs 還可以預防大鼠腎缺血再灌注損傷后毛細血管稀疏和組織損傷。去除 EVs 中的 miR-126 和 miR-296 腎臟保護作用消失，說明 miR-126 和 miR-296 血管生成中起關鍵作用[10]。脂肪來源的間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）通過外泌體將 miR-125a 轉運至 EC，抑制 DLL4 表達，增加頂細胞的形成，在體內外發(fā)揮促血管生成的作用[11]。此外，用內皮分化培養(yǎng)基對脂肪源性 MSCs 預處理可使微泡生成增加，這些微泡通過傳遞 miR-31 和抑制低氧誘導因子-1α 的抑制因子表達，增強促血管生成的作用[12]。小鼠骨髓來源的 MSC 經(jīng)過腦缺血組織提取物處理后產生的 EVs 富含 miR-210，miR-210 被轉運至內皮細胞中抑制 EFNA3 基因的表達，促進血管生成[13]。同時，人臍帶源性 MSC 產生的外泌體通過激活 Wnt 4/β-catenin 通路發(fā)揮促血管生成作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞源性的微泡可以通過將 miR-150 轉運到 EC 發(fā)揮促血管生成的作用[15]。

表 1 EVs 調控血管生成的主要機制

EVs 可以通過轉運某些蛋白質發(fā)揮促血管生成的作用。通過調節(jié)細胞的培養(yǎng)條件，可以大大提高 EVs 的血管生成潛能。研究發(fā)現(xiàn)用血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）處理脂肪源性 MSCs 產生的 EVs 中c-kit、干細胞因子（stem cell factor，SCF）和基質金屬蛋白酶含量的增加，從而增強其促血管生成作用。低氧處理臍帶源性 MSCs 產生的 EVs 富含 VEGF，從而增加促血管生成的作用。單側腎缺血大鼠經(jīng)靜脈注射這種 EVs，增加了缺血腎臟的毛細血管密度，從而發(fā)揮保護腎功能的作用[16]。血小板產生的微泡能促進內皮細胞遷移、增殖、管狀結構的形成，同時增強損傷后內皮再生的能力。研究發(fā)現(xiàn)，用從動脈粥樣硬化患者外周血中分離的血小板源性微泡處理循環(huán)血管生成細胞，可使大鼠缺血的后肢新生血管增多[17]。這種促血管生成作用與血小板源性微泡釋放的受激活調節(jié)正常 T 細胞表達和分泌因子有關。在主動脈環(huán)模型鼠中，血小板源性微泡通過傳遞血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）和 PDGF 以及激活 PI3 激酶、src 激酶和 ERK 通路，以劑量依賴性的方式發(fā)揮促血管生成作用[18]。同時，在慢性心肌缺血的大鼠模型中，靜脈注射血小板微泡可增加心肌功能和毛細血管的數(shù)量，保護心功能。此外，C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）具有促血管生成的作用。2012 年澳大利亞學者在急性心肌梗死的患者血液標本中發(fā)現(xiàn)微泡可以轉運單體 CRP 至ECs 并活化 ECs[19]。近期研究發(fā)現(xiàn)，攜帶音猬因子（sonic hedgehog，SHH）的微泡通過抑制 NO 的產生和減少氧化應激，改善了血管緊張素 II 誘導的高血壓和主動脈內皮功能[20]。

EVs 也可以通過轉運一些轉錄因子發(fā)揮促血管生成的作用，如 pSTAT 3 和 pSTAT 5。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血狀態(tài)下，骨髓源性 MSCs 的外泌體通過轉運 pSTAT 3 及激活 NF-κB 通路發(fā)揮促血管生成的作用[21-22]。而 IL-3 處理的ECs 產生的 EVs 通過將 pSTAT 5轉運到 EC，增加 cyclinD1 翻譯，從而促血管生成[8]。

2.2 EVs 抗血管生成的作用機制

EVs 的抗血管生成作用在視網(wǎng)膜病變和腫瘤血管生成等病理性血管生成方面具有重要的治療作用。EVs 誘導內皮細胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，通過內皮細胞的 CD36 和 EVs 磷脂酰絲氨酸結合，激活 Fyn 激酶和 NADPH 氧化酶，產生活性氧，抑制 ECs 遷移和管腔形成[23]。研究發(fā)現(xiàn)，T 淋巴細胞產生的微泡對血管生成的抑制作用是由低密度脂蛋白受體介導的，將靶 ECs 和腫瘤細胞中的低密度脂蛋白受體敲除，導致微泡攝取減少，導致 T 淋巴細胞微泡抗血管生成作用消失[24]。

3 EVs 治療血管生成的前景

在各種研究的基礎上，EVs 已經(jīng)成為細胞間通訊的主要形式，在血管生成中起著重要的作用。EVs 廣泛參與了血管生成、生長和成熟。自 21 世紀初以來，EVs 已在黑色素瘤[25]、非小細胞肺癌[26-27]、結直腸癌[28]、I 型糖尿病（Nct 02138331）患者中進行了臨床試驗。雖然參與研究的患者數(shù)量不多，但這些臨床試驗證明了 EVs 在人體內應用的可行性和安全性。最近，一項前瞻性的臨床試驗被啟動，評價自體血漿來源的外泌體對頑固性皮膚潰瘍（Nct 02565264）患者傷口愈合的影響。這項臨床試驗將提供關于 EVs 干預血管生成的可行性和有效性的重要信息。

4 問題與展望

EVs 領域的研究發(fā)展迅速，現(xiàn)在已經(jīng)成為了研究熱點，尤其在癌癥、卒中等疾病中研究廣泛。EVs 不僅可以通過自身發(fā)揮作用，還可以通過運輸藥物發(fā)揮作用，甚至用于一些基因治療。由此可見 EVs 是極具前景的領域。越來越多的研究證實了 EVs 通過調節(jié) ECs 參與血管生成。與其他調節(jié)腫瘤、腦卒中、動脈粥樣硬化、損傷后修復等疾病中的血管生成的方法相比，EVs 治療具有靶向性、無免疫原性、無致瘤性、安全性、儲存和運輸方便等優(yōu)點。EVs 將有希望成為干預血管生成的新手段，但 EVs 研究仍面臨著許多挑戰(zhàn)。其中關于 EVs 的應用濃度仍然存在很大爭議。研究發(fā)現(xiàn)，EVs 對血管生成的影響是與劑量相關的。而現(xiàn)有研究 EVs 的量化方法不同，所以 EVs 發(fā)揮調節(jié)血管生成而又無副作用的濃度無法確定。不同的分離和提純 EVs 的方法也影響其完整性及功能。此外，EVs 的細胞來源和給藥途徑是其組織分布的關鍵決定因素。因此，在正常和病理條件下建立 EVs 的最佳給藥途徑、產生條件、統(tǒng)一分離提純及量化方法有助于提高其治療效果。

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國家自然科學基金（81371709）

田野，Email：yetian6@163.com

2018-12-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.011