孫彬裕，曲守方，于婷，孫楠，孫晶，胡澤斌，黃杰

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甲胎蛋白免疫測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的建立

孫彬裕*，曲守方*，于婷，孫楠，孫晶，胡澤斌，黃杰

100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所

甲胎蛋白（AFP）是一種血清糖基化蛋白，在正常成人血清中含量極少。AFP 主要由胎兒卵黃囊和肝臟產(chǎn)生，其次是胃腸道黏膜、腎臟也可少量合成。AFP 是單鏈糖蛋白，分子量 65 ~ 70 kD，其物理化學(xué)特性和氨基酸組成類似于血清白蛋白，但抗原性不同[1-3]。作為一種腫瘤標(biāo)記物，AFP 可以用于腫瘤的診斷療效監(jiān)控，70% ~ 95% 的原發(fā)性肝癌患者呈現(xiàn) AFP 水平升高，AFP 異常升高提示原發(fā)性肝癌的發(fā)生[4-7]。妊娠期可通過 AFP 監(jiān)測(cè)進(jìn)行疾病的篩查和診斷，產(chǎn)前普查羊水中 AFP 水平可監(jiān)控胎兒異常，孕婦血清異常升高提示胎兒神經(jīng)管缺陷畸形，如脊柱裂、無腦兒、腦積水等，AFP 降低提示未出生的嬰兒有唐氏綜合征的危險(xiǎn)性[8-11]。

目前國(guó)內(nèi)外有 70 多家具有注冊(cè)證的 AFP 測(cè)定試劑盒應(yīng)用于臨床，檢測(cè)方法包括化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法和時(shí)間分辨免疫熒光法等。但各家試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，使用的抗體不同，使其對(duì)同一份標(biāo)本測(cè)定的同一腫瘤標(biāo)記的結(jié)果可能會(huì)有所差異，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果不具有可比性[12]。為了解決這一問題，AFP 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化極為重要。臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵在于測(cè)定結(jié)果的量值溯源。實(shí)現(xiàn)量值溯源，一般可通過參考方法（或參考測(cè)量程序）和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來進(jìn)行，AFP 沒有參考方法，但有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[13-14]。而研制 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，能夠規(guī)范我國(guó) AFP 測(cè)定試劑盒的質(zhì)量，促進(jìn)我國(guó) AFP 檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化。本實(shí)驗(yàn)室開展了 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的研制，并進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 AutoLumo A2000 Plus 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供；Maglumi 2000 Plus 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀由深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供；卓越 C1800 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀由上海科華生物工程股份有限公司提供；iMark Bio-Rad 酶標(biāo)儀由艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司提供；DR6608 時(shí)間分辨熒光免疫分析儀由廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供；Advia Centaur XPT 和 Immulite 2000 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀由西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司提供；Access 2 全自動(dòng)免疫分析儀由貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司提供；Cobas e411 電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀由羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司提供；Liaison XL 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀由索靈診斷醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司提供；HISCL-5000 全自動(dòng)免疫分析儀由希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司提供。

1.1.2 試劑盒 甲胎蛋白定量檢測(cè)試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）為鄭州安圖生物工程股份有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）為深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白定量測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）為上?？迫A生物工程股份有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）為艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白定量測(cè)定試劑盒（時(shí)間分辨免疫熒光法）為廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白測(cè)定試劑盒（直接化學(xué)發(fā)光法）和甲胎蛋白測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）為西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）為貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白檢測(cè)試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）為羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）為索靈診斷醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司產(chǎn)品；甲胎蛋白檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）為希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（Alpha fetoprotein, Human, NIBSC code: AFP，100 000 IU/支）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品制備 精確量取來源于臍帶血提取的甲胎蛋白原料，加至賦形劑（去激素血清）內(nèi)，充分混勻后，配制成理論濃度約為 900 IU/ml 的 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品溶液，置于 2 ~ 8℃過夜，次日經(jīng) 0.22 μm 濾膜無菌過濾，每支安瓿 0.5 ml 進(jìn)行分裝，凍干制備成 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品。

1.2.2 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品瓶間精密度實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取 10 支候選品，使用鄭州安圖生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量檢測(cè)試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法），平行進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算其效價(jià)比的變異系數(shù)（CV%）。

1.2.3 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 每次隨機(jī)選取候選品 2 支，37 ℃放置 1 ~ 12 周后，以–20 ℃保存的 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品（記為 0 周）為對(duì)照，使用鄭州安圖生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量檢測(cè)試劑盒，對(duì)穩(wěn)定性候選品樣本平行進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算其效價(jià)比。

1.2.4 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品協(xié)作標(biāo)定 在各廠家試劑盒反應(yīng)體系的線性范圍內(nèi)，以 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，對(duì)候選品（隨機(jī)抽?。┻M(jìn)行協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。按各試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理采用 Log-log 雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析。

1.2.5 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品一致性研究 收集 20 ~40 份新鮮的臨床 AFP 血清樣本，肉眼無溶血、脂血和黃疸，濃度范圍包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度且呈現(xiàn)一定的濃度梯度，每個(gè)濃度收集 2 ~ 8 ml，500 μl 或 1 ml 分裝，–20 ℃以下保存。配制不同濃度的 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，然后使用鄭州安圖生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量檢測(cè)試劑盒，同時(shí)測(cè)定 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品以及上述的血清樣本。每個(gè)樣品的測(cè)量結(jié)果為該測(cè)量系統(tǒng)的測(cè)量結(jié)果。分別以 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品為標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析血清樣本測(cè)定的結(jié)果，評(píng)價(jià) AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品與 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的一致性。

2 結(jié)果

2.1 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品瓶間精密度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)抽取 10 支候選品，使用鄭州安圖生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量檢測(cè)試劑盒平行進(jìn)行分析測(cè)定，AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品 1 ~ 10 瓶間精密度的結(jié)果：效價(jià)比均值為 1.0283，標(biāo)準(zhǔn)差為 0.014，變異系數(shù)為 1.4%（表 1）。結(jié)果表明，AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的瓶間一致性好。

2.2 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

37 ℃放置1 ~ 12 周后，與–20 ℃保存的標(biāo)準(zhǔn)品候選品（作為 0 周）效價(jià)比在 0.91 ~ 1.03 之間（表 2）。結(jié)果表明，AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品非常穩(wěn)定。

2.3 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品協(xié)作標(biāo)定

AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的免疫活性理論值為 900 IU/支。本次協(xié)作研究中，以 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，在各檢測(cè)系統(tǒng)上測(cè)定候選品，用 Log-log 數(shù)學(xué)模型擬合，要求 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品與候選品的劑量-反應(yīng)曲線均不顯著偏離平行（檢驗(yàn)），并對(duì)各試劑盒的標(biāo)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和匯總。若檢驗(yàn)結(jié)果> 0.05，表明候選品與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-反應(yīng)曲線平行，候選品與 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品同質(zhì)。根據(jù) 10 個(gè)廠家 11 種試劑盒協(xié)作標(biāo)定結(jié)果，最終確定 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的免疫活性為 930 IU/安瓿（表 3）。

表 1 瓶間精密度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

表 2 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

表 3 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

2.4 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品一致性研究

在檢測(cè)系統(tǒng)上同時(shí)測(cè)定 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品以及 40 份臨床 AFP 血清樣本。分別以 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品為標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析臨床 AFP 血清樣本測(cè)定的結(jié)果。以臨床樣本測(cè)定結(jié)果做散點(diǎn)圖，Y 軸為以 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的結(jié)果，X 軸為以 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品為標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的結(jié)果，進(jìn)行線性相關(guān)性分析，線性相關(guān)系數(shù)為 0.9991（圖 1）。研究結(jié)果表明，AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品與 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的一致性很好。

圖 1 一致性結(jié)果

3 討論

AFP 測(cè)定試劑盒在臨床上主要用于原發(fā)性肝癌的高危人群的篩查、輔助診斷、療效和治療及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等。制定統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品有助于使各實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化。本次協(xié)作標(biāo)定中選用的 AFP 測(cè)定試劑盒涉及化學(xué)發(fā)光、酶聯(lián)免疫法和時(shí)間分辨免疫熒光法，涵蓋了我國(guó)市場(chǎng)上的主要產(chǎn)品。本次研究以 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，將 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-反應(yīng)曲線平行，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品與 AFP 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品同質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)量值傳遞的追溯性和連續(xù)性。

通過對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品的瓶間精密度、熱穩(wěn)定性和一致性研究，此批 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品能滿足作為 AFP 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的要求，可用于 AFP 免疫分析及相應(yīng)試劑盒的性能評(píng)價(jià)。

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*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.015

黃杰，Email：jhuang5522@126.com；胡澤斌，Email：huzbcmba@163.com

2019-01-14