廖偉聰 黃建芳 向軍儉 馮沛然 何亞運(yùn) 張 宇

(暨南大學(xué)抗體工程研究中心，廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510632)

細(xì)胞程序性凋亡配體(Programmed cell death ligand-1，PD-L1)在腫瘤微環(huán)境中的異常高表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤免疫逃逸的作用之一。PD-L1通過與表達(dá)在免疫細(xì)胞上的PD-1相互作用，往往可導(dǎo)致免疫細(xì)胞上PD-1抑制性信號(hào)的活化與轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮強(qiáng)有力的免疫抑制作用。而相關(guān)研究報(bào)道，在某些腫瘤環(huán)境中PD-L1的異常高表達(dá)，能抑制免疫系統(tǒng)清除功能，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[1-4]。

PD-1/PD-L1抗體藥物是當(dāng)前腫瘤免疫療法中最受矚目的抗體靶向藥物，其作用機(jī)理主要是通過阻斷T細(xì)胞PD-1與腫瘤細(xì)胞PD-L1的結(jié)合來削弱T細(xì)胞上PD-1介導(dǎo)的抑制作用，從而增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用[5,6]。目前已有PD-1抗體藥物Keytruda和Opdivo,PD-L1抗體藥物Tecentiq、Imfinzi和Bavencio等5個(gè)PD-1/PD-L1抗體藥物在國(guó)外上市。

PD-1/PD-L1免疫療法在多種難治愈的癌癥上都具有良好的治療效果，但其總體治療的客觀反應(yīng)率偏低[7,8]。Topalian等[9]通過觀察42名患有多種實(shí)體瘤的患者，發(fā)現(xiàn)有36%PD-L1陽(yáng)性患者對(duì)使用Nivolumab存在客觀反應(yīng)，而PD-L1陰性患者則無(wú)一例產(chǎn)生客觀反應(yīng)，提示實(shí)體瘤的PD-L1表達(dá)量與PD-1/PD-L1抗體藥物療效呈正相關(guān)。Balar等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)典霍奇金淋巴瘤(Classical hodgkin lymphoma，CHL)是普遍高表達(dá)PD-L1/2的癌癥，而臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1免疫抑制劑療法對(duì)CHL患者有很好的療效(CHL患者經(jīng)Nivolumab治療后，66%的患者的腫瘤出現(xiàn)萎縮，甚至有7例患者的腫瘤完全消失[11])。綜上提示，PD-1/PD-L1抗體藥物療效與PD-L1表達(dá)量呈正相關(guān)，然而并非所有類型的腫瘤均高表達(dá)PD-L1，且臨床上腫瘤患者的PD-L1表達(dá)也呈現(xiàn)多樣性，因此在PD-1/PD-L1靶向藥物治療前對(duì)患者進(jìn)行PD-L1表達(dá)強(qiáng)度分析顯得尤為重要。

綜上所述，對(duì)腫瘤患者的PD-L1表達(dá)量檢測(cè)分析能一定程度上判斷PD-1/PD-L1靶向藥物的治療效果，為臨床上PD-1/PD-L1靶向藥物的個(gè)體化及最佳化治療提供一定的參考價(jià)值。

目前，大部分PD-L1單抗的研究主要集中于研究其抑瘤效果，而從其檢測(cè)效果出發(fā)研究的很少，本研究主要側(cè)重于其對(duì)腫瘤PD-L1表達(dá)水平的檢測(cè)。本研究通過單克隆細(xì)胞株的制備及對(duì)單克隆抗體的鑒定和腫瘤細(xì)胞、組織驗(yàn)證，篩選出高親和力、高特異性的抗人PD-L1單抗的雜交瘤細(xì)胞株，該株抗體為患者個(gè)體化使用PD-1/PD-L1靶向藥物以及患者最佳療法篩選的后續(xù)研究提供重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 人PD-L1重組蛋白(Novop-rotein，Catalog# C315)，HAT/HT、弗氏佐劑(完全、不完全)、PEG2000均購(gòu)自Sigma，胎牛血清(Gemini，Catalog# 900-108)，單抗亞類檢測(cè)試劑盒SBA Clonotyping System-HRP ( Southern-Biotech，Catalog #5300-05)，酶標(biāo)二抗(KPL，Catalog # 074-1086)，Protein G親和層析柱(GE，5 ml)，惡性腫瘤組織芯片(西安艾麗娜生物科技有限公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)BALB/c純系雌性小鼠，周齡為6周，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞株(丹麥株)、K562、OV2008、C13、H1299等腫瘤細(xì)胞株(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2方法

1.2.1抗PD-L1單克隆抗體的制備 使用重組PD-L1胞外段蛋白以腹部皮下多點(diǎn)免疫的方法免疫7周齡BALB/c小鼠，免疫劑量為50 μg/只[12]。采用常規(guī)細(xì)胞融合和間接ELISA等方法篩選出4株陽(yáng)性克隆株。小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞制備腹水，腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和Protein G親和層析純化后凍干備用。

1.2.2PD-L1單抗Ig類及亞類的鑒定 使用SBA Clonotyping System-HRP試劑盒對(duì)篩選的單抗的Ig類及亞類進(jìn)行測(cè)定，所有操作嚴(yán)格依照試劑盒說明書操作。

1.2.3PD-L1單抗特異性的鑒定 PD-L2蛋白以0.5 μg/ml包板，采用5%脫脂奶粉封閉；檢測(cè)單抗以O(shè)D450值約為2的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋加樣，其余步驟參照常規(guī)間接ELISA操作。

1.2.4PD-L1單抗親和常數(shù)的測(cè)定 非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定其親和常數(shù)( Affinity constant，Ka)。參考Beatty等[13]的方法，按照公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]-[Ab]t)計(jì)算親和常數(shù)Ka值。

1.2.5Western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá) 使用強(qiáng)裂解液將腫瘤細(xì)胞裂解提取總蛋白[14]，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后再電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉膜后加入濃度為1 μg/ml的Ab3單抗，4℃過夜孵育后取出膜并用PBS-T洗滌3次，加入HRP酶標(biāo)二抗(1∶8 000) 室溫孵育1 h，PBS-T洗滌5次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)，膠片曝光后進(jìn)行顯影和定影，并掃描膠片，灰度軟件分析其灰度差異。

1.2.6免疫組化檢測(cè)腫瘤組織PD-L1的表達(dá) 選擇高中低PD-L1表達(dá)水平的膀胱癌和黑色素瘤病理組織芯片為檢測(cè)樣本，免疫組化采用常規(guī)的S-P法，用本研究制備的Ab3單抗為一抗(工作濃度10 μg/ml)，其余步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行；腫瘤組織切片厚度約為2 μm。用DAB顯色和蘇木紫復(fù)染；在倒置顯微鏡下觀察，拍照并進(jìn)行圖像分析。判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)被染上棕黃色的腫瘤細(xì)胞為PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞；陽(yáng)性率<25%為低表達(dá)，陽(yáng)性率在25%～50%為中度表達(dá)，陽(yáng)性率>50%為高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行作圖，并分析不同數(shù)據(jù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1PD-L1單克隆制備 以重組人PD-L1胞外段蛋白為免疫原，BALB/c小鼠經(jīng)3次免疫后，取最高滴度免疫血清的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，通過有限稀釋法篩選陽(yáng)性細(xì)胞株，共獲得4株可穩(wěn)定分泌抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為Ab1、Ab2、Ab3、Ab4。經(jīng)體內(nèi)誘生制備腹水，腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和Protein G純化后，用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定其純度，結(jié)果如見圖1所示，在分子量為50 kD和25 kD位置左右清晰可見抗體重鏈、輕鏈條帶，無(wú)雜帶，抗體純化效果良好。

2.2PD-L1單抗特異性鑒定 結(jié)果如表1所示，使用單抗亞類檢測(cè)試劑盒測(cè)定單抗亞類，除Ab2是IgG2a類外都是IgG1類抗體。純化后的單抗ELISA效價(jià)為4.1～20.0 ng/ml之間；制備的單抗與PD-L2蛋白均無(wú)交叉反應(yīng)；采用非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定4株單抗親和常數(shù)，其中Ab3單抗的親和常數(shù)最高，為7.85×109M-1。

2.3Western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平 用Western bolt檢測(cè)不同腫瘤細(xì)胞裂解液中的PD-L1，結(jié)果如圖2A所示，Ab3抗體能與多種腫瘤細(xì)胞(OV2008、C13、K562、H1299、MCF-7)中PD-L1蛋白結(jié)合，無(wú)明顯雜帶，說明抗體特異性良好。WB條帶應(yīng)用Quantity One軟件，通過比較WB條帶的灰度分析腫瘤細(xì)胞間PD-L1的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖2B所示， OV2008細(xì)胞株的PD-L1表達(dá)水平相對(duì)最高，

圖1 抗人PD-L1單克隆抗體的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of anti-hPD-L1 MabsNote: M.Protein Marker；1.Ab1；2.Ab2；3.Ab3；4.Ab4.

表1 單抗特異性鑒定

Note："-"Indicating that the OD450 value is less than twice the negative value,proved no cross-reaction with the PD-L2 protein.

C13細(xì)胞株的PD-L1表達(dá)水平相對(duì)最低。結(jié)果表明，Ab3抗體能與天然PD-L1蛋白結(jié)合，并能通過WB方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4免疫組化檢測(cè)膀胱癌和黑色素瘤組織PD-L1的表達(dá)水平 用免疫組化和Ab3單抗檢測(cè)不同分期的膀胱癌和黑色素瘤組織切片；采用高倍鏡下人工閱片的方式統(tǒng)計(jì)病理切片PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞率(PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù))。其中不同PD-L1表達(dá)水平的膀胱癌組織切片的PD-L1陽(yáng)性率分別為8.3%、47.7%、97.5%(見圖3)，其PD-L1陽(yáng)性率符合高中低PD-L1表達(dá)水平的膀胱癌組織芯片的預(yù)期結(jié)果。而黑色素瘤組織切片PD-L1陽(yáng)性率分別為11.4%、40.5%、100%(見圖4)，其PD-L1陽(yáng)性率符合高中低PD-L1表達(dá)水平的黑色素瘤組織芯片的預(yù)期結(jié)果。膀胱癌和黑色素瘤組織芯片PD-L1陽(yáng)性率的結(jié)果表明，Ab3單抗能檢測(cè)出不同分期的膀胱癌和黑色素瘤組織中 PD-L1的不同表達(dá)水平。

圖2 Western blot分析不同腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平Fig.2 Expression level of PD-L1 in different kinds of tumor cell lines were analyzed by Western blotNote: A.Western blot；B.Relative grayscale level.

圖3 Ab3單抗免疫組化檢測(cè)膀胱癌組織PD-L1表達(dá)水平Fig.3 PD-L1 expression level of bladder cancer by using ICH and Ab3 MabNote: →.The arrows indicated the PD-L1 positive cells;A.Low expression cases(8.3%);B.Moderate expression cases(47.7%);C.High expression cases(97.5%).

圖4 Ab3單抗免疫組化檢測(cè)黑色素瘤PD-L1表達(dá)水平Fig.4 PD-L1 expression level of Melanoma cancer by using ICH and Ab3 MabNote: →.The arrows indicated the PD-L1 positive cells;A.Low expression cases(11.4%);B.Moderate expression cases(40.5%);C.High expression cases(100%).

3 討論

在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞上調(diào)PD-L1表達(dá)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的PD-L1與T細(xì)胞上的PD-1相互結(jié)合，從而抑制了T細(xì)胞的活化增殖，導(dǎo)致T細(xì)胞失能。這是由于腫瘤細(xì)胞不能像正常免疫調(diào)節(jié)那樣，通過單核吞噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞上PD-L1與T細(xì)胞上PD-1識(shí)別結(jié)合激活PD-1/PD-L1信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[15,16]。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示患者的PD-L1表達(dá)水平與PD-1/PD-L1抑制劑免疫療法的收益存在明顯正相關(guān)性，PD-L1對(duì)患者使用PD-1/PD-L1抗體藥物的預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要意義。

免疫組化檢測(cè)腫瘤患者免疫檢查點(diǎn)PD-L1的表達(dá)水平作為腫瘤患者精準(zhǔn)治療的重要推薦判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。臨床上免疫組化檢測(cè)患者腫瘤組織切片上PD-L1表達(dá)水平，有助于優(yōu)化PD-1/PD-L1抑制劑免疫療法治療腫瘤患者的預(yù)后，提高患者用藥受益。本研究獲得Ab3單抗具有較高親和力，Ab3單抗的效價(jià)和親和力常數(shù)分別為4.1 ng/ml、7.85×109M-1。Western blot結(jié)果表明Ab3單抗能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的天然PD-L1，并能檢測(cè)不同分期的膀胱癌、黑色素瘤組織切片的PD-L1表達(dá)水平的差異，表明Ab3單抗可開發(fā)成腫瘤病理診斷抗體。

致謝:感謝暨南大學(xué)第一臨床學(xué)院病理科陸元志教授給予免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)的熱情指導(dǎo)和大力幫助。