曾國棟 陳智凱 林祥博 尹崇高 李洪利

(山東省濰坊醫(yī)學院生物科學與技術(shù)學院，濰坊261053)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，近年的發(fā)病率逐年上升，嚴重危害全球女性生命健康[1]。原位乳腺癌并不致命，90%以上患者死亡的主要原因是癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[2]。近年來，臨床上對于乳腺癌的治療已有很大的進展，但乳腺癌的發(fā)病率及死亡率仍呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[3]。因此，研究乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制可以為治療乳腺癌提供新的依據(jù)。microRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長度約為22 個核苷酸[4,5]。它不編碼蛋白質(zhì)，卻可以通過與目標 mRNA 的互補結(jié)合，下調(diào)靶基因的表達或翻譯，從而調(diào)控細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等行為[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)miR-31在多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用，包括肝癌、肺癌、胃癌、神經(jīng)性膠質(zhì)瘤、前列腺癌、乳腺癌等，且多數(shù)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關(guān)[8-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-31可以靶向調(diào)控Dock1，通過此機制抑制神經(jīng)性膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[14]，但是其能否在乳腺癌中起相同作用尚未見報道，因此本文通過對乳腺癌中miR-31及Dock1的研究，為乳腺癌的臨床治療及預(yù)防其侵襲和轉(zhuǎn)移提供新的靶點和途徑。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、RPMI1640購自美國Hyclone公司，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script?RT reagent Kit和SYBR?Prime Script?miRNA RT-PCR Kit 購自大連TaKaRa公司，Transwell小室購于Corning公司，Matrigel購于BD公司，抗體試劑均購于Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人正常上皮乳腺細胞MCF-10A培養(yǎng)于含血清、氫化可的松(Hydrocortisone)、霍亂毒素(Cholera toxin)、胰島素(Insulin)、表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，乳腺癌細胞MDA-MB-231培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，MCF-7細胞使用MEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)。所有細胞均置于37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR) 莖環(huán)法 逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR具體實驗步驟見本課題組先前實驗結(jié)果[15]。 PCR條件為95℃ 5 s、63℃ 30 s、72℃ 30 s進行35個循環(huán)，采用 U6作為內(nèi)參。 miR-31上游引物：GCGAGGCAAGATGCTGGC，下游引物：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT，莖環(huán)序列：GTCGTATCCAGTGCAG-GGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTAT。

1.2.3Western blot 實驗過程見本課題組先前實驗過程[16]，所用抗體濃度如下：β-actin(1∶1 000)、Dock1(1∶1 000)、E-cadherin(1∶500)、Vimentin(1∶1 000)。 β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4Transwell侵襲實驗 將轉(zhuǎn)染后的150 μl(4×105cells/ml)細胞懸液添加到Transwell小室上層中，下層加入20%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后4%多聚甲醛固定20 min，使用Giemsa染色35 min，PBS清洗3次，于顯微鏡下隨機選取10個視野拍照計數(shù)，取平均值為實驗的最終結(jié)果。所有實驗均重復3次。

2 結(jié)果

2.1miR-31及Dock1在人正常乳腺上皮細胞與乳腺癌細胞中的表達情況 qRT-PCR、Western blot分別檢測人正常乳腺上皮細胞MCF-10A、乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7中miR-31、Dock1的表達情況。結(jié)果顯示，miR-31在MCF-7細胞中的表達水平高于MDA-MB-231細胞，但都明顯低于正常肺上皮細胞MCF-10A細胞中的表達水平；MDA-MB-231細胞中Dock1的表達水平高于MCF-7細胞，Dock1在MCF-10A細胞中表達水平最低(見圖1)。結(jié)果提示，miR-31在乳腺癌中為抑癌基因，Dock1為癌基因。

圖1 miR-31及Dock1在人正常乳腺上皮細胞與乳腺癌細胞中的表達Fig.1 Expression of miR-31 and Dock1 in human normal mammary epithelial cells and breast cancer cellsNote: A.Expression level of miR-31 in the cells of each group ;B.Expression level of Dock1 in the cells of each group;C.Gray value of B diagram;*.P<0.05.

圖2 MDA-MB-231細胞miR-31及Dock1的轉(zhuǎn)染效率Fig.2 Transfection efficiency of miR-31 and Dock1 in MDA-MB-231 cellsNote: A.Transfection efficiency of miR-31 in MDA-MB-231 cells;B.Transfection efficiency of Dock1 in MDA-MB-231 cells;C.Gray value of B diagram;*.P<0.05.

2.2轉(zhuǎn)染后miR-31和Dock1在各組乳腺癌細胞中的表達情況 qRT-PCR、Western blot檢測轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后各組乳腺癌細胞中miR-31、Dock1的表達情況，結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞在轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒后miR-31的表達水平與正常組相比無明顯差距，但在轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒后miR-31的表達水平明顯升高。Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組乳腺癌細胞中Dock1的表達情況，MDA-MB-231對照組與正常組比較Dock1表達水平幾乎無差距，轉(zhuǎn)染敲除質(zhì)粒后Dock1的表達水平明顯下調(diào)(見圖2)。結(jié)果提示轉(zhuǎn)染成功。

2.3轉(zhuǎn)染后各組乳腺癌細胞中Dock1蛋白的表達變化 為了檢測轉(zhuǎn)染過后各組細胞中Dock1蛋白的表達變化情況而采用Western blot實驗。結(jié)果顯示MDA-MB-231/miR-31細胞相比于MDA-MB-231/NC細胞中Dock1的表達水平明顯下調(diào)(見圖3)，結(jié)果提示，miR-31可以負向調(diào)控Dock1蛋白的表達。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組乳腺癌細胞中Dock1蛋白的表達變化Fig.3 Expression of Dock1 protein in breast cancer cells after transfectionNote: A.Expression of Dock1 protein in breast cancer cells after transfection;B.Gray value of A diagram;*.P<0.05.

圖4 miR-31靶向調(diào)控Dock1對乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響Fig.4 Effect of miR-31 targeting Dock1 on invasion and metastasis of breast cancer cellsNote: A.Changes in cell invasion and metastasis of cells in each group;B.Counting the cells of each cell group in the A diagram;*.P<0.05.

圖5 miR-31靶向調(diào)控Dock1對乳腺癌EMT的影響Fig.5 Effect of miR-31 targeting Dock1 on EMT in breast cancerNote: A.Changes of EMT markers in the each group cells;B.Gray value of A diagram;*.P<0.05.

2.4miR-31靶向調(diào)控Dock1對乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響 為了驗證miR-31靶向調(diào)控Dock1在乳腺癌中的具體作用，利用Transwell侵襲實驗檢測miR-31對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示MDA-MB-231/miR-31組相比于MDA-MB-231/NC組穿過基底膜的細胞數(shù)明顯減少，而與MDA-MB-231/miR-31+con組相比無明顯差距；MDA-MB-231/miR-31+Dock1組與MDA-MB-231/miR-31+con組相比穿過基底膜的細胞數(shù)明顯增多(見圖4)，差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示，miR-31可以通過調(diào)控Dock1表達來抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

2.5miR-31靶向調(diào)控Dock1對乳腺癌EMT的影響 用Western blot檢測EMT標志分子的表達變化來驗證miR-31和Dock1與乳腺癌EMT的聯(lián)系。結(jié)果顯示，MDA-MB-231/NC細胞與MDA-MB-231細胞E-cadherin、Vimentin表達水平相比無明顯變化，MDA-MB-231/miR-31和MDA-MB-231/miR-31+con細胞相比于MDA-MB-231/NC細胞中E-cadherin表達水平顯著上調(diào)，在MDA-MB-231/miR-31+Dock1細胞中E-cadherin的表達水平與對照組相比無統(tǒng)計學意義；與MDA-MB-231/NC細胞相比，MDA-MB-231/miR-31和MDA-MB-231/miR-31+con細胞中Vimentin表達水平明顯下調(diào)，MDA-MB-231/miR-31+Dock1細胞中Vimentin的表達水平幾乎無變化(見圖5)。結(jié)果提示，miR-31通過靶向調(diào)控Dock1蛋白的表達，進而調(diào)節(jié)乳腺癌EMT的發(fā)生。

3 討論

乳腺癌細胞常在特定生理或病理狀態(tài)下發(fā)生EMT，即喪失正常上皮細胞的特性，獲得間質(zhì)細胞的形態(tài)及遷移運動能力[17]，黏附性降低的癌細胞可以浸潤轉(zhuǎn)移至其他組織或隨血液播散至全身，形成轉(zhuǎn)移，危及生命。EMT的標志物有很多，如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等，E-cadherin是上皮組織中的一類依賴Ca2+的細胞間黏附分子，可以維持細胞間黏附性和極性，Vimentin是間質(zhì)細胞標志分子，E-cadherin表達下調(diào)、Vimentin的表達異常上調(diào)是EMT發(fā)生的重要特征[18]。 眾多研究發(fā)現(xiàn)miR-31可協(xié)調(diào)抑制多種靶基因，從而調(diào)控惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的發(fā)生[19]。Gao等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-31通過負向調(diào)控LATS2可以調(diào)節(jié)食管癌的EMT；Cottonham等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-31通過聚集TIAM1來調(diào)節(jié)結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移。本實驗結(jié)果顯示miR-31在乳腺癌細胞中表達相對較低，改變?nèi)橄侔┘毎衜iR-31的表達會影響乳腺癌的侵襲能力及EMT的發(fā)生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-31通過靶向調(diào)控Dock1對膠質(zhì)瘤EMT的發(fā)生起抑制作用，提示miR-31可能通過調(diào)控Dock1來發(fā)揮作用。

Dock1(Dedicator of cytokinesis 1)屬于Dock 家族蛋白之一，亦是整合素信號通路的重要組分[22]。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)Dock1的蛋白結(jié)構(gòu)域DHR2 (Dock homology regions 2)與Crk蛋白結(jié)合，可激活Rac1并發(fā)揮促進細胞遷移等作用。此外，Dock1還在乳腺癌、肺癌等諸多惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[24,25]，本研究采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細胞中Dock1表達水平的變化，證實miR-31參與調(diào)節(jié)Dock1的表達。

綜上所述，本研究證實miR-31可以調(diào)控Dock1的表達來抑制乳腺癌細胞EMT的發(fā)生，進而抑制乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，這一發(fā)現(xiàn)將為乳腺癌的治療提供新的思路與途徑。但miR-31是否會結(jié)合其他靶基因共同調(diào)控乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移目前尚不清楚，需要我們進行更加深入的研究。