楊延兵 張 涵 王潤豐 鄧立剛 秦 嶺 陳二影 管延安

(山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所1，濟南 250100) (山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所2，濟南 250100)

谷子[Setariaitalica(L.) P. Beauv.]又稱為粟，去殼后稱為小米，在植物學上屬禾本科狗尾草屬。它起源于中國，栽培歷史悠久，據(jù)考古學研究，距今約有一萬多年的栽培歷史[1-2]，曾長期是我國北方的主要糧食作物。它抗旱耐瘠、水分利用效率高、適應性廣，至今在干旱和半干旱地區(qū)仍是重要的糧食作物。小米營養(yǎng)豐富且各種成分平衡，其品質在營養(yǎng)保健中的作用獨特，加強研究、發(fā)掘利用這一作物的營養(yǎng)保健價值，對于促進農(nóng)業(yè)供給側結構性改革，豐富提高人們?nèi)找嬖鲩L的物質生活需求有重要意義。

多數(shù)谷子品種的小米為黃色，黃色的主要來源為黃色素。小米黃色素主要組分為天然類胡蘿卜素，主要含有葉黃素、玉米黃質以及少量的隱黃質、β-胡蘿卜素等[3-5]，這些類胡蘿類素不僅具有保護視覺與上皮細胞的作用，而且可以提高人體免疫力，淬滅體內(nèi)過多自由基，預防多種癌癥，同時對口腔潰瘍、皮膚病等都有很好的療效。不同谷子品種的小米黃色素及主要組分類胡蘿卜素含量存在差異，研究培育類胡蘿卜含量高，色澤金黃，外觀品質好的谷子新品種是谷子遺傳育種的重要目標之一，因此定量測定谷子品種小米黃色素含量對于選育高類胡蘿卜素含量的品種有重要的意義。同時，定量測定小米黃色素含量有助于小米產(chǎn)品質量評判的標準化，促進小米產(chǎn)品的精深加工。

小米黃色素具有一定的耐熱性、耐還原性和耐氧化性,對光和酸性條件穩(wěn)定性較差，不溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有機溶劑,其乙醇提取物最大吸收波長為445 nm或446 nm[6-8]；利用超聲波輔助提取可以明顯增加小米黃色素產(chǎn)量[9-10]。這些研究主要側重于對小米黃色素化學性質及其提高小米黃色素得率，研究探討利用提取的小米黃色素作為色素添加劑應用食品工業(yè)等方面，而關于小米黃色素的定量測定研究則較少。楊延兵等[12-13]參考美國谷物化學師協(xié)會AACC 14-50[11]測定小麥粉黃色素的方法研究了我國谷子品種小米黃色素含量的差異及小米黃色素與外觀品質的關系,研究表明小米黃色素含量的高低不僅和小米的營養(yǎng)價值有關，而且也是反映小米外觀品質的重要指標。然而，小米黃色素組成和小麥粉黃色素組成可能存在一定的差異。因此，優(yōu)化完善谷子品種中小米黃色素的測定，比較準確地測定小米黃色素含量，盡可能減少誤差，具有重要的意義。

本研究從不同溶劑、提取時間、提取方式和回收率等方面對小米黃色素的測定進行了研究，以期為小米黃色素的定量測定以及谷子品質育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

谷子品種：濟谷12、濟谷16、濟谷17、濟谷19、豫谷18。

標準品及試劑：葉黃素、玉米黃素、β-胡蘿卜素標樣： Chromadex 公司；β-隱黃質：Sigma公司(美國)；三氯甲烷、無水乙醇、正丁醇等試劑：國藥集團。

1.2 儀器設備

RETSCH粉碎機；SORVALL臺式多用離心機-冷凍型；UV2600紫外/可見光分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 不同提取因素對小米黃色素的提取實驗

不同溶劑提取小米黃色素：選用無水乙醇、水飽和正丁醇3種不同溶劑進行提取。

不同提取方式提取小米黃色素：無水乙醇、水飽和正丁醇2種提取液振蕩提取(1、2、3 h)和振蕩提取(1、2、3 h)+超聲波提取20 min。

利用水飽和正丁醇提取不同時間的小米黃色素：1、3、5、7、24 h。

1.3.2 建立標準曲線

1.3.3 樣品處理測定

用礱谷機把谷子籽粒脫殼，把小米超離心粉碎。稱取1.00 g樣品放入約30 mL具塞的離心管內(nèi)，加入10.0 mL水飽和正丁醇，蓋緊塞子，混旋器上混合，使樣品充分濕潤。把離心管放在往復振蕩機上避光振蕩提取一定時間，然后靜置10 min。10 000×g離心8 min至上清液清亮，以水飽和正丁醇空白作對照，吸收波長 445 nm處測定提取液吸光度，計算黃色素含量。

小米黃色素含量=ε·A，ε為根據(jù)標準曲線得到的系數(shù)，A為提取液吸光度。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑對小米黃色素的影響

利用無水乙醇和水飽和正丁醇提取不同谷子品種小米黃色素，進行光譜掃描，記錄最大峰值。無水乙醇和水飽和正丁醇提取同一品種小米黃色素掃描光譜有一定差異(圖1為濟谷19小米2種提取液掃描光譜)。2種溶劑提取的小米黃色素最大吸收峰值也略有差異(表1)，不同品種無水乙醇提取液最大波峰值平均為445.8 nm，水飽和正丁醇提取液最大波峰值平均為447.5 nm。說明2種提取液提取的小米黃色素在質和量上有一定差異。同一提取液不同品種之間最大吸收波長也略有差異，這說明不同品種之間在黃色素的組分上存在差異。

圖1 不同提取溶劑提取濟谷19小米黃色素吸收光譜圖

品種無水乙醇提取液/nm水飽和正丁醇提取液/nm濟谷12446.0447.6濟谷16446.0447.4濟谷17445.4447.4濟谷19446.0447.6豫谷18445.4447.3平均445.8447.5

圖2 小米黃色素及部分類胡蘿卜標準物質光譜圖

2.2 小米黃色素與主要組分標準物質光譜比較

對小米黃色素提取物及葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質、β-胡蘿卜素等標準物質在350～550 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描(圖2)。不同類胡蘿卜素之間光譜特征有一定差異，小米黃色素的光譜特征和葉黃素光譜特征最接近。葉黃素最大峰值445 nm，玉米黃質最大峰值452 nm，β-隱黃質最大峰值451 nm，β-胡蘿卜素最大峰值450 nm，小米黃色素最大峰值447.5 nm。

2.3 提取溶劑對小米黃色素含量提取效率的影響

分別利用水飽和正丁醇和無水乙醇往復震蕩提取3 h進行提取完全度實驗，測定5個谷子品種小米黃色素含量，結果如表2。每個品種無水乙醇提取液小米黃色素測定值都低于水飽和正丁醇提取小米黃色素測定值，乙醇提取小米黃色素測定值只有水飽和正丁醇提取測定值的66.93%～73.76%，平均為69.78%，利用水飽和正丁醇提取的小米黃色素較完全。

表2 不同提取溶劑對小米黃色素含量的影響

2.4 提取方式對小米黃色素含量的影響

以濟谷16小米樣品為試材，分別利用水飽和正丁醇和無水乙醇采用振蕩提取和振蕩提取+超聲波20 min 2種方式，提取不同時間(1、3、5 h)，測定小米黃色素含量，結果表3。同一提取時間，水飽和正丁醇提取黃色素含量顯著大于乙醇提取黃色素含量。2種溶劑同一時間振蕩提取后，再用超聲波提取20 min，黃色素含量平均值明顯增大，但標準偏差也相應增大，測定黃色素含量的穩(wěn)定性變差。

表3 不同提取方式小米黃色素含量的影響/mg/kg

2.5 提取時間對小米黃色素含量的影響

利用水飽和正丁醇提取小米黃色素1、2、3、5、7、24 h，測定結果如表4。提取1 h黃色素含量略低，3～7 h小米黃色素含量基本維持在平臺期，黃色素含量的變化很小。因此，小米黃色素振蕩提取3 h后測定，在2～4 h時間內(nèi)測定完畢，小米黃色素含量變化相對較小。振蕩提取24 h后小米黃色素含量有略微下降，這可能與提取時間過長，部分小米黃色素降解所致。所以測定小米黃色素含量以先振蕩提取3 h，再開始測定為宜。

表4 提取時間對小米黃色素含量的影響/mg/kg

2.6 標準曲線的建立

繪制的β-胡蘿卜素標準曲線如圖3，線性范圍0～5.0 μg/mL，標準曲線回歸方程：小米黃色素含量=54.7·A，相關系數(shù)r=0.999 9。

圖3 標準曲線

2.7 不同谷子品種黃色素樣品測定與回收率分析

精確稱取1.0 g不同谷子品種小米樣品，每個樣品重復5次，按照1.3.5制備的樣品溶液，振蕩提取3 h，測定小米黃色素含量，計算相對標準偏差(RSD)。同時，每個樣品再稱取5份，添加β-胡蘿卜素標準溶液，計算加標回收率，結果如表5。結果5個谷子品種相對標準偏差RSD 1.16%～2.14%，都小于3%，表明該方法準確可靠，精密度較高。各樣品加標回收率為92.77%～103.18%，表明該方法測定結果準確。

表5 樣品測定結果及加標回收率測定結果(n=5)

3 討論

本研究分別利用無水乙醇和水飽和正丁醇提取小米黃色素，利用水飽和正丁醇提取小米黃色素較完全，得率較高。利用水飽和正丁醇提取小米黃色素，經(jīng)過高速離心后一般提取上清液透明，測定值較穩(wěn)定，比較適于對小米黃色素含量做定量測定。但正丁醇會易散發(fā)出令人難聞的氣味，測定最好在通風櫥內(nèi)完成。用無水乙醇提取，小米黃色素得率低于水飽和正丁醇提??；而且離心后，部分品種提取液易出現(xiàn)一定的渾濁，測定值不太穩(wěn)定，不太適用于大量樣品谷子黃色素的定量測定；但由于無水酒精提取液酒精易揮發(fā)，酒精揮發(fā)后得到黃色素固體粉末，且酒精無毒，適于食用色素的提取。

有關研究表明，利用超聲波提取，可以提高小米黃色素產(chǎn)量[9-10]，本研究表明超聲波的確能增加黃色素產(chǎn)量。但是，在實驗過程中，超聲波提取后實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定性變差，有的提取液中有細微小顆粒，疑似提取液渾濁。造成這種現(xiàn)象的原因可能是超聲提取狀態(tài)下，產(chǎn)生細微的固體或液體顆粒，而這種小顆粒難以通過加大離心轉速解決，造成實驗結果誤差較大；因此定量測定小米黃色素，提取過程不宜使用超聲波處理，直接振蕩提取就可。

本實驗研究了不同提取時間、提取方式對小米黃色素含量的影響，提取時期短提取不充分，研究條件下認為振蕩提取3 h是比較適宜的時間；3～5 h時間內(nèi)避光振蕩提取對小米黃色素變化較小，這為大批量測定實驗樣品提供了參考。

本研究分別利用無水乙醇和水飽和正丁醇提取小米黃色素，無水乙醇提取液最大吸收波長平均445.8 nm，水飽和正丁醇最大吸收波長平均447.5 nm，與其他研究結果類似[7-8,15]。葉黃素為小米中黃色素最主要組分，本研究中小米葉黃素最大吸收峰波長為445.8 nm，這和報道的葉黃素波長基本相同[16]，細微的波長差異可能在于物質的純度及測定誤差。AACC 14-50測定小麥的黃色素含量測定波長為435.8 nm，其主要根據(jù)混合物中主要組分葉黃素設定測定的吸收波長[16]，本研究中小米黃色素的吸收光譜和葉黃素吸收光譜最相似，葉黃素的最大吸收波長為445 nm, 所以本研究中黃色素含量都在445 nm下測定。研究利用β-胡蘿卜素制作標準曲線，而小米黃色素主要成分為葉黃素和玉米黃質，β-胡蘿卜素含量較少[5]，小米黃色素為多種胡蘿卜素或類胡蘿卜素的混合物，所以測定的小米黃色素含量不是絕對含量，而是同一測定系統(tǒng)下的相對值。

4 結論

實驗完善優(yōu)化了小米黃色素的提取測定方法，以水飽和正丁醇為提取液，避光振蕩提取3 h，10 000×g離心8 min，在445 nm下測定上清液吸光度，以β-胡蘿卜素制作標準曲線，計算小米黃色素含量。該方法靈敏準確、精密度較高，能滿足小米黃色素測定的要求。