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      微紫青霉果膠酶降解再造煙葉高濃混合漿中果膠的研究

      2019-04-12 00:04許春平曲利利姜宇馬宇平孫斯文王宣靜

      許春平 曲利利 姜宇 馬宇平 孫斯文 王宣靜

      摘要:為降低再造煙葉中的果膠含量,采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)微紫青霉產(chǎn)果膠酶降解果膠的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,分析了酶解前后樣品的熱裂解產(chǎn)物,并將酶解后樣品抄造制絲添加至卷煙中進(jìn)行感官評(píng)價(jià),結(jié)果表明:微紫青霉產(chǎn)果膠酶降解果膠的最佳反應(yīng)條件為酶活力3000 U/mL,高濃混合漿干重與粗酶液體積的料液比1GA6FA1,反應(yīng)溫度50 ℃,處理時(shí)間3 h.在此條件下果膠降解率達(dá)到最大,為28.63%,相對(duì)分子量由341 kDa減小到55 kDa.酶解后樣品裂解產(chǎn)物的組成和含量發(fā)生明顯變化,除醇類(lèi)物質(zhì)外,其他香味物質(zhì)酚類(lèi)、醛酮類(lèi)、酯類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)減少.將酶解后的樣品抄造制絲添加于卷煙中,香氣質(zhì)豐滿(mǎn)細(xì)膩,透發(fā)性、甜潤(rùn)感增強(qiáng),刺激性減小,余味純凈舒適,吸食品質(zhì)得以改善,但勁頭略有不足.

      關(guān)鍵詞:微紫青霉;果膠酶;再造煙葉;果膠降解率

      中圖分類(lèi)號(hào):TS41文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI:10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.004

      文章編號(hào):2096-1553(2019)01-0027-09

      0 引言

      果膠是構(gòu)成煙草細(xì)胞壁的主要物質(zhì)之一,在煙草中的含量約占5%~13%(若無(wú)特指,百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)),它是以半乳糖醛酸為主鏈,并連接著2-吡喃型鼠李糖基的復(fù)合多糖類(lèi)物質(zhì)[1-3].這類(lèi)物質(zhì)在熱解時(shí)會(huì)產(chǎn)生甲醇,并進(jìn)一步氧化為甲醛、甲酸等,這些氧化產(chǎn)物會(huì)增加煙草燃吸時(shí)的刺激性,對(duì)煙草的內(nèi)在品質(zhì)和安全性產(chǎn)生不利影響[4-6],對(duì)人體有害.因此,適當(dāng)降低煙葉中果膠的含量,對(duì)于提升煙葉品質(zhì)、降低卷煙危害,具有重要的意義.

      煙草果膠降解通常采用生物酶解方法.施林燕[7]通過(guò)對(duì)煙梗絲施加復(fù)合酶,使煙梗絲中的果膠含量降低13.08%.于建軍等[8]研究發(fā)現(xiàn),對(duì)煙葉施加果膠酶后會(huì)使煙草香氣物質(zhì)含量增加29.94%,可能是由于施加果膠酶后使煙葉中總糖含量增加所致.于興偉等[9]采用固態(tài)發(fā)酵法用黑曲霉處理煙梗,發(fā)現(xiàn)煙草中果膠含量也明顯降低.馬東萍等[10]選用復(fù)合中性纖維素酶、酸性蛋白酶、復(fù)合果膠酶和中性脂肪酶配制成一種改性添加劑,這種改性添加劑可對(duì)煙梗中果膠、蛋白質(zhì)等大分子化合物進(jìn)行有效的生物降解和轉(zhuǎn)化,從而改善萃取液中的致香物質(zhì).柏婷[11]利用生物酶解技術(shù)和化學(xué)技術(shù)對(duì)果膠進(jìn)行降解.結(jié)果表明,當(dāng)果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí),煙草中果膠含量由18.61%降低至 9.52%,且再造煙葉煙香較濃,刺激性明顯下降,感官品質(zhì)也得到明顯改善.然而,利用微紫青霉生產(chǎn)果膠酶并將其應(yīng)用于煙草果膠降解的報(bào)道則相對(duì)較少[12-14].鑒于此,本研究擬采用從煙田土壤中分離出的微紫青霉(Penicillium janthinellum)sw09菌株,根據(jù)該菌株高產(chǎn)果膠酶的特性,利用其粗酶液對(duì)造紙法再造煙葉混合漿料進(jìn)行果膠降解處理,并進(jìn)一步開(kāi)展化學(xué)分析和感官質(zhì)量評(píng)價(jià),以期為煙葉品質(zhì)提升和卷煙危害成分降低研究提供參考和借鑒.

      1 材料與方法

      1.1 材料、試劑與儀器

      供試材料:配方煙絲,河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供;高濃混合漿,取自河南煙草工業(yè)薄片有限公司工藝生產(chǎn)線(xiàn);果膠酶為由鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室篩選的微紫青霉sw09產(chǎn)出的粗果膠酶液,即發(fā)酵上清液.

      試劑:3,5-二硝基水楊酸(DNS),天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn);果膠標(biāo)準(zhǔn)品(酯化度67%~70%),Sigma\|Aldrich公司產(chǎn);D-(+)-半乳糖醛酸一水化合物標(biāo)準(zhǔn)品(純度97%)和0.15%的咔唑溶液,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn).

      儀器:ATY124型電子分析天平,日本島津公司產(chǎn);Ultra3400型紫外分光光度計(jì),北京普源精電科技有限公司產(chǎn);HH-2型電熱恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn);Agilent6890/5973型氣質(zhì)聯(lián)用儀,安捷倫科技有限公司產(chǎn);CDSPYROPROBE2000裂解儀,上海光譜儀器有限公司產(chǎn).

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液的獲取

      將活化后的微紫青霉sw09接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度分別為葡萄糖50 g/L,酵母浸粉3 g/L,KH2PO4 1 g/L,果膠2 g/L,pH=5)[15].發(fā)酵條件為:5 L發(fā)酵罐培養(yǎng),攪拌速度150 r/min,通氣量2 V/(V·min),發(fā)酵溫度32 ℃,初始pH=5,發(fā)酵時(shí)間72 h.待發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液離心取上清液,即為果膠酶粗酶液[16].

      1.2.2 微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液降解混合漿中果膠單因素試驗(yàn)

      酶活的定義為:在45 ℃,pH=5條件下,1.0 mL酶液每min分解果膠產(chǎn)生1.0 μg 的D-半乳糖醛酸,即為一個(gè)酶活單位(1 U/mL).通過(guò)單因素試驗(yàn)研究不同酶活力、酶解時(shí)間和反應(yīng)溫度條件下,微紫青霉產(chǎn)果膠酶粗酶液對(duì)混合漿中果膠含量的降解情況.

      1.2.2.1 不同酶活力的粗酶液降解果膠能力的試驗(yàn)[17]

      將不同酶活力的粗酶液(14 000 U/mL,6000 U/mL,3000 U/mL,1000 U/mL,700 U/mL 和450 U/mL),以料液比(m(混合漿干重/g)GA6FAV(粗酶液體積/mL),下同)為1GA6FA3的比例均勻噴施于10 g混合漿上,在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解結(jié)束后,置于70 ℃烘箱中使酶滅活,測(cè)定各處理組樣品果膠含量,每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

      1.2.2.2 不同酶解時(shí)間下粗酶液降解果膠能力的試驗(yàn)

      將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液,以料液比1GA6FA3,均勻噴施于10 g混合漿上,在50 ℃下分別酶解0.5 h,1.0 h,1.5 h,2.0 h,2.5 h和3.0 h.待酶解結(jié)束后,置于70 ℃烘箱中使酶滅活,測(cè)定各處理組樣品果膠含量,每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

      1.2.2.3 不同料液比降解果膠能力的試驗(yàn)

      將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液,以不同料液比(1GA6FA1,1GA6FA3,1GA6FA5,1GA6FA7和1GA6FA9)均勻噴施于10 g混合漿上,在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解結(jié)束后,置于70 ℃烘箱中使酶滅活,測(cè)定各處理組樣品果膠含量,每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

      1.2.2.4 不同反應(yīng)溫度下粗酶液降解果膠能力的試驗(yàn)

      將酶活力為14 000 U/mL的粗酶液,以料液比1GA6FA3,均勻噴施于10 g混合漿上,分別在30 ℃,35 ℃,40 ℃,45 ℃,50 ℃和55 ℃條件下酶解2.0 h.待酶解結(jié)束后,置于70 ℃烘箱中使酶滅活,測(cè)定各處理組樣品果膠含量,每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

      1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),以果膠降解率為優(yōu)化目標(biāo),對(duì)酶活力、酶解時(shí)間、料液比、反應(yīng)溫度等果膠降解條件進(jìn)行優(yōu)化.

      1.3 測(cè)定方法

      1.3.1 果膠含量測(cè)定方法

      分別稱(chēng)取5 g(精確至0.001 g)經(jīng)果膠酶處理前后的樣品進(jìn)行粉碎,過(guò)250目篩.然后參考劉玉佳等[18]的方法對(duì)樣品中的果膠含量進(jìn)行定量分析.

      根據(jù)咔唑比色法測(cè)定果膠含量,以D-(+1)-半乳糖醛酸一水化合物為標(biāo)準(zhǔn)品.首先移取1 mL待測(cè)液于裝有6 mL濃H2SO4的試管,搖勻.在85 ℃水浴條件下加熱15 min.待試管冷卻后,加入0.3 mL 0.15%的咔唑無(wú)水乙醇溶液,搖勻,暗置30 min后在 530 nm下測(cè)吸光度值.根據(jù)咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和下列公式,計(jì)算待測(cè)液中果膠含量[19].

      果膠含量=C×V×K×100/(W×106)

      式中,C為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得的果膠提取稀釋液的果膠含量/(μg·m-1),V為果膠提取液原液體積/ mL,K為果膠提取液稀釋倍數(shù),W為樣品質(zhì)量/g,106為質(zhì)量單位換算系數(shù).

      實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組果膠含量的測(cè)定按照上述方法進(jìn)行,果膠降解率的計(jì)算公式如下:

      Ei=(C0-Ci)/C0×100%

      式中,Ei為果膠的降解率/%,C0為空白對(duì)照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的質(zhì)量濃度/(mg·mL-1),Ci為加酶處理的樣品中果膠水解生成的半乳糖醛酸的質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)[13].

      1.3.2 果膠相對(duì)分子量的測(cè)定

      在1.3.1中總果膠提取液中加入質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的活性炭進(jìn)行脫色,脫色完成后離心提取上清液進(jìn)行旋蒸,待旋蒸至原體積1/5后加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇用于沉淀果膠,靜置、離心得到果膠粗品后再?gòu)?fù)溶以Sevage法[18]除蛋白,再經(jīng)醇沉、離心、冷凍干燥得到果膠粉末.

      用濃度為0.2 mol/mL的NaCl緩沖液平衡Sepharose CL-6B凝膠柱,每5 min收集一管洗脫液,洗脫速度為1.5 mL/min.用2 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(T-150,T-70,T-40,T-10)分別上樣,采用苯酚-硫酸法[20]在波長(zhǎng)490 nm處跟蹤顯色,峰值處為洗脫體積Ve,標(biāo)準(zhǔn)糖的分配系數(shù)Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo),其中Vt為柱床體積/mL,Vo為外水體積/mL.以Kav為橫坐標(biāo),葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對(duì)數(shù)(logM)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).在相同條件下測(cè)定酶解前后果膠的Ve/mL,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其相對(duì)分子量.

      1.3.3 熱裂解產(chǎn)物的測(cè)定

      稱(chēng)取一定量酶解前后的樣品置于裂解裝置中,對(duì)裂解產(chǎn)物進(jìn)行重復(fù)測(cè)定.裂解條件參考郝輝等[13]的方法.試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值.

      1.4 感官評(píng)價(jià)

      在正交試驗(yàn)得到的最佳酶解條件下,對(duì)高濃混合漿進(jìn)行酶解,然后抄造切絲,按煙絲重量15%的比例與配方煙絲均勻混合后上機(jī)卷制.酶解處理后的樣品作為試驗(yàn)組,100 ℃煮沸滅活酶液處理后的樣品作為對(duì)照組,蒸餾水處理后的樣品作為空白組.

      按照標(biāo)準(zhǔn)要求[21],將處理前后的煙絲進(jìn)行卷制,然后在(22±2)℃,(60±5)%相對(duì)濕度的恒溫恒濕箱中平衡48 h后進(jìn)行感官評(píng)價(jià).

      2 結(jié)果與分析

      2.1 果膠酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果

      圖1為酶活力、酶解時(shí)間、料液比和反應(yīng)溫度對(duì)果膠降解率的影響.由圖1可以看出,隨著酶活力的減小,樣品中果膠的降解率呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì).當(dāng)酶活力達(dá)到3000 U/mL后,進(jìn)一步增加酶活力對(duì)樣品果膠的降解率無(wú)明顯影響.因此選擇酶活力為14 000 U/mL,6000 U/mL,3000 U/mL的粗酶液作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中酶活力的3個(gè)水平.果膠的降解率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大.當(dāng)酶解時(shí)間增加到2.5 h時(shí),樣品中果膠的降解率達(dá)到最大值,接近28%.因此選擇酶解時(shí)間2.0 h,2.5 h和3.0 h作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中酶解時(shí)間的3個(gè)水平.料液比對(duì)樣品中果膠的降解率的影響不大,因此選擇料液比1GA6FA1,1GA6FA3,1GA6FA5作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中料液比的3個(gè)水平.隨反應(yīng)溫度的升高,樣品中果膠的降解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)反應(yīng)溫度為45 ℃時(shí),果膠的降解率達(dá)到最大值,接近28%.因此選擇溫度40 ℃,45 ℃和50 ℃作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中反應(yīng)溫度的3個(gè)水平.

      2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

      根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取酶活力(A),料液比(B),酶解溫度(C),反應(yīng)時(shí)間(D)4種因素設(shè)計(jì)L9(34)的正交試驗(yàn)方案,試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2.

      對(duì)表1中極差R值大小進(jìn)行比較可知,各個(gè)因素對(duì)降解率的影響由大到小依次為:反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫度>酶活力>料液比.其中酶活力以3000 U/mL為最優(yōu),料液比以1GA6FA1為最優(yōu),酶解溫度以50 ℃為最優(yōu),反應(yīng)時(shí)間以3.0 h為最優(yōu),4種因素對(duì)果膠降解率的最優(yōu)組合為A3B1C3D3.在該最優(yōu)組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證,果膠的降解率達(dá)到最大28.63%.楊慧芳[22]以酶活 1 467.29 U/mL的青霉JXY-17發(fā)酵粗酶液在50 ℃條件下酶解煙梗12 h,果膠質(zhì)降低29.38%.與其結(jié)果相比,本研究的酶活力更高,降解效果相似,但酶解時(shí)間大大縮短,更適用于工業(yè)生產(chǎn).施林燕[7]以工業(yè)復(fù)合酶酶解煙梗絲4 h,果膠降解13.08%.與其結(jié)果相比,本研究的降解效果大大提升.

      從表2可以看出,反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的F值均大于F0.01(2,18)=6.01,說(shuō)明反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)果膠的降解率影響極顯著;酶活力和料液比的F值均大于F0.05(2,18)=3.55,但小于F0.01(2,18)=6.01,說(shuō)明酶活力和料液比對(duì)果膠的降解率影響顯著.

      2.3 相對(duì)分子量的測(cè)定結(jié)果

      以分配系數(shù)(Kav)為橫坐標(biāo)、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對(duì)數(shù)(logM)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),結(jié)果如圖2所示.其線(xiàn)性回歸方程為

      y=-5.485 8x+6.537 9R2=0.993 7

      由此計(jì)算得出的高濃混合漿中果膠相對(duì)分子量為341 kDa,經(jīng)果膠酶處理后樣品中果膠的平均相對(duì)分子量明顯降低至55 kDa,說(shuō)明經(jīng)微紫青霉果膠酶處理后,樣品中果膠大分子得到有效降解.

      2.4 樣品酶處理前后熱裂解產(chǎn)物分析

      實(shí)驗(yàn)選擇300 ℃,600 ℃和900 ℃共3個(gè)溫度對(duì)高濃混合漿酶解前后的熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行裂解分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn),在裂解溫度為600 ℃時(shí)裂解物質(zhì)最多,裂解效果最好,因此本實(shí)驗(yàn)僅列出熱裂解溫度為600 ℃的結(jié)果.根據(jù)官能團(tuán)不同,將檢測(cè)出的化合物分為7類(lèi),分析結(jié)果見(jiàn)表3.

      從表3可以看出,與原樣品相比,混合漿經(jīng)酶解后香氣組分和含量均發(fā)生了變化.其中,18種酚類(lèi)物質(zhì)總量由7.10%減少到0.63%,以苯酚、鄰甲酚、對(duì)甲酚的減少最為明顯,酚類(lèi)物質(zhì)含量的下降有助于減少雜氣的生成.果膠熱裂解生成乙酸[8],酶解后的果膠含量降低,乙酸含量由12.71%減少到10.65%,減輕了煙氣吸味的刺激性.煙氣中酚類(lèi)物質(zhì)和羧酸類(lèi)物質(zhì)部分來(lái)自于果膠的分解,由于果膠被果膠酶酶解,導(dǎo)致裂解產(chǎn)物中酚類(lèi)物質(zhì)和羧酸類(lèi)物質(zhì)下降[23].酶解后含氮雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)總含量降低,由5.98%降至4.28%,其中煙堿由2.2%降低至1.88%,減少了有毒物質(zhì)的生成.酶解后醇類(lèi)物質(zhì)總量由2.51%增加到2.83%.酶解后樣品中醛酮類(lèi)含量由16.27%減少到15.45%,由于煙草熱裂解過(guò)程中產(chǎn)生的大部分揮發(fā)性羰基類(lèi)物質(zhì)是在纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等裂解之后的燃燒過(guò)程中形成的,因此果膠被降解,會(huì)導(dǎo)致煙草熱裂解后揮發(fā)性羰基類(lèi)物質(zhì)含量下降[24],醛酮類(lèi)物質(zhì)含量下降有可能會(huì)影響卷煙的風(fēng)格特性,但是可以通過(guò)加香加料或者增加配方煙絲的用量進(jìn)行彌補(bǔ).

      2.5 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

      感官評(píng)吸結(jié)果見(jiàn)表4.由表4可知,將經(jīng)過(guò)微紫青霉產(chǎn)果膠酶處理的高濃混合漿抄造制絲加入卷煙后,卷煙香氣質(zhì)豐滿(mǎn)細(xì)膩,煙氣透發(fā)性更好,甜潤(rùn)感增強(qiáng),刺激性減輕,也減少了煙氣中的雜氣,口感發(fā)澀程度減小且余味純凈舒適,吸食品質(zhì)得以改善,但勁頭略有不足.

      3 結(jié)論

      本文通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)微紫青霉產(chǎn)果膠酶降解高濃混合漿中果膠的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,對(duì)酶解前后樣品的熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行了分析,并將酶解后樣品添加至卷煙中進(jìn)行感官評(píng)價(jià),得到如下結(jié)論.

      1)微紫青霉酶降解高濃混合漿中果膠的最優(yōu)條件為:酶活力3000 U/mL,料液比1GA6FA1,酶解溫度50 ℃,處理時(shí)間3 h,此時(shí)樣品中果膠降解率為28.63%,果膠分子量由341 kDa降低至55 kDa.

      2)酶解后樣品的熱裂解產(chǎn)物中,除醇類(lèi)外,其他香味物質(zhì)醛酮類(lèi)、酯類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)等的含量均減少.

      3)將酶解后的高濃混合漿抄造制絲加入卷煙后,卷煙香氣質(zhì)豐滿(mǎn)細(xì)膩,煙氣透發(fā)性更好,甜潤(rùn)感增強(qiáng),刺激性減輕,也減少了煙氣中的雜氣,口感發(fā)澀程度減小且余味純凈舒適,吸食品質(zhì)得以改善,但勁頭略有不足.

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