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      白腐菌液體發(fā)酵降解煙梗木質(zhì)素的研究

      2019-04-12 00:04宋麗麗張永良張志平王光路楊旭張靖楠
      關(guān)鍵詞:木質(zhì)素

      宋麗麗 張永良 張志平 王光路 楊旭 張靖楠

      摘要:以白腐菌P. chrysosporium為對(duì)象,采用連續(xù)傳代馴化的方法提升菌體對(duì)煙堿的耐受度.通過(guò)比較人工陳化與液體發(fā)酵對(duì)煙梗中木質(zhì)素的降解效率,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明,馴化后的白腐菌P. chrysosporium可有效定植于煙梗上,在34 ℃,接種量6%的最適發(fā)酵條件下液體發(fā)酵24 h,煙梗中木質(zhì)素含量為1.93%,降解了23.11%,

      與人工陳化3個(gè)月煙梗木質(zhì)素降解情況相當(dāng),總糖和葡萄糖含量分別增加10.84%和4.86%,在一定程度上消除了蛋白質(zhì)燃燒產(chǎn)生的不良?xì)馕?,改善了煙梗燃燒時(shí)產(chǎn)生的木質(zhì)氣.

      關(guān)鍵詞:煙梗;白腐菌;木質(zhì)素;液體發(fā)酵;連續(xù)傳代馴化

      中圖分類號(hào):TS49文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI:10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.005

      文章編號(hào):2096-1553(2019)01-0036-07

      0 引言

      煙梗是煙葉的重要組成部分,通過(guò)梗葉分離,可得到占煙葉總重25%左右的煙梗[1].我國(guó)是煙草大國(guó),每年通過(guò)打葉復(fù)烤產(chǎn)生大量的煙梗,但目前這部分煙草副產(chǎn)物的綜合利用程度較低[2-3].煙梗中總糖和煙堿含量較低,而纖維素和木質(zhì)素等細(xì)胞壁物質(zhì)含量高,造成了糖堿比的失調(diào),燃吸時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激性和雜氣,澀口,香氣量少[4].因此,改善煙梗及其制品的內(nèi)在品質(zhì),提高梗絲的香氣、吃味和梗絲填充值成為煙草工業(yè)研究的熱點(diǎn).

      煙草中的木質(zhì)素是由芥子醇、香豆醇和松柏醇等苯丙烷衍生物單體構(gòu)成的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜、無(wú)定型且具有生物多態(tài)性的生物大分子,它填充在半纖維素和纖維素的空隙之間且緊密結(jié)合,共同形成了細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)[5-6].木質(zhì)素作為生物質(zhì)的三大主要成分之一,在熱解時(shí)會(huì)產(chǎn)生甲基酚、二甲基酚和兒茶酚等有害物質(zhì).減少煙草薄片中的木質(zhì)素含量既有利于減少煙草薄片燃燒時(shí)產(chǎn)生的有害物質(zhì),也能改善煙草薄片的吸味[7-8].同時(shí),煙梗中糖堿比失調(diào)造成的吸食品質(zhì)不佳也限制了煙梗在卷煙中的添加比例[9].利用微生物的方法對(duì)煙梗進(jìn)行發(fā)酵是提高煙梗利用價(jià)值的一條有效途徑.微生物能夠通過(guò)直接或間接利用煙葉或煙梗中的果膠、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和微量元素等,分解代謝合成出不同種類的生物酶,而生物酶能夠催化底物分子內(nèi)部某些化學(xué)鏈的斷裂,加速底物大分子的降解和某些有害物質(zhì)的分解,進(jìn)而通過(guò)特定微生物的吸收、利用、轉(zhuǎn)化,形成一系列有益小分子化合物,在煙草行業(yè)減毒加香方面具有廣闊的應(yīng)用前景[10-11].

      白腐菌是對(duì)木質(zhì)素具有較強(qiáng)降解能力的一類真菌,它能夠通過(guò)分泌木質(zhì)素降解酶系對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行降解或改性,從而降低木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)屏障,使大分子化合物(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素)降解為低分子物質(zhì).利用白腐菌這一特性可對(duì)秸稈等草類原料進(jìn)行固體發(fā)酵處理,進(jìn)而對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行選擇性降解[12-13].利用白腐菌降解煙梗中的木質(zhì)素,不僅能夠降低煙梗在抽吸時(shí)產(chǎn)生的刺激性及木質(zhì)氣,而且可以將大分子化合物改性降解,使小分子化合物有效釋放,對(duì)改善煙氣香味有著潛在的貢獻(xiàn)[14].遲建國(guó)[15]利用白腐菌降低煙葉中木質(zhì)素的含量,達(dá)到了降低卷煙煙氣雜氣、提升卷煙吸食品質(zhì)的目的.劉志昌等[16]使用經(jīng)白腐菌Coriolus versicolor T42處理后的煙梗制備重組煙葉,并將其添加至卷煙中,卷煙的香氣、雜氣、刺激性和協(xié)調(diào)性都得到了明顯改善.白腐菌由于具有選擇性降解木質(zhì)素的特性,在改善煙梗品質(zhì)和提高煙梗利用率方面有極大的應(yīng)用潛力.黃孢原毛平革菌(P. chrysosporium)是白腐菌的模式菌株,在污水處理、土壤修復(fù)以及降解木質(zhì)素方面均有廣泛的應(yīng)用[6],但對(duì)煙梗木質(zhì)素降解和品質(zhì)改善等的研究還鮮有涉及.鑒于此,本研究利用白腐菌模式菌株黃孢原毛平革菌(P.chrysosporium)降解煙梗中的木質(zhì)素,參照人工陳化煙梗木質(zhì)素的降解情況,選擇適宜的白腐菌液體發(fā)酵煙梗條件,以快速降低煙梗中木質(zhì)素的含量,達(dá)到改善煙梗內(nèi)在品質(zhì)、提升煙梗利用率、降低卷煙生產(chǎn)成本的目的.

      1 材料與方法

      1.1 試劑與儀器

      白腐菌P. chrysosporium,來(lái)源于鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,4 ℃條件下斜面保存.

      煙梗,由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供,自然晾干后存放.

      馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):土豆200 g/L,蔗糖20 g/L,121 ℃下滅菌20 min.

      馬鈴薯肉湯培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基):土豆200 g/L,蔗糖20 g/L,瓊脂20 g/L,121 ℃下滅菌20 min.

      煙梗培養(yǎng)基:將煙梗粉碎后過(guò)40目篩,稱取10 g置于250 mL三角瓶中,加入100 mL蒸餾水121 ℃下滅菌30 min.

      儀器:UV-1800雙光速紫外-可見(jiàn)光光度計(jì),上海欣茂儀器有限公司產(chǎn);SW-CJ-1D凈化工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn);LRH-1500F生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn);QYC-2012C恒溫?fù)u床,上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn);Agilent7820A高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司產(chǎn);MS205DU分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn);AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀,德國(guó)SEAL公司產(chǎn);PHS-3C 型pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn).

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 白腐菌P.chrysosporium馴化

      由于煙梗中的煙堿對(duì)微生物有毒害作用,會(huì)抑制其生長(zhǎng),因此采用逐級(jí)連續(xù)傳代馴化法對(duì)初始菌株進(jìn)行馴化,得到可以在高濃度煙堿條件下生長(zhǎng)的白腐菌P. chrysosporium菌種.具體馴化過(guò)程見(jiàn)表1.

      1.2.2 煙梗人工陳化

      將經(jīng)過(guò)馴化的白腐菌P. chrysosporium制成孢子懸液(7.50×108個(gè)/mL),均勻噴灑于煙梗表面,控制煙梗濕度為65%,將煙梗置于鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行人工陳化(室內(nèi)溫度10~35 ℃,相對(duì)濕度 40%~70%),陳化過(guò)程中注意通風(fēng)和防蟲(chóng).分別在陳化 0個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月時(shí)取樣,進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分分析.

      1.2.3 煙?;瘜W(xué)成分測(cè)定

      按照煙草化學(xué)成分測(cè)定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),采用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定煙梗中總糖、葡萄糖、總氮、煙堿[17-19].煙梗中纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定方法參照美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室NREL制定的標(biāo)準(zhǔn)[20].有機(jī)酸測(cè)定采用王瑞新的方法[21].水溶液pH值采用pH計(jì)法測(cè)定[22].

      1.2.4 白腐菌P. chrysosporium發(fā)酵煙梗

      將白腐菌P. chrysosporium斜面菌種接種于PDB培養(yǎng)基,在30 ℃,150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d,在無(wú)菌條件下接種6 mL種子液于煙梗培養(yǎng)基中,于30 ℃下培養(yǎng).

      1.2.5 不同發(fā)酵條件下煙梗木質(zhì)素含量的測(cè)定

      1.2.5.1 發(fā)酵時(shí)間 吸取6 mL種子液加入煙梗培養(yǎng)基中,將接種白腐菌P. chrysosporium后的煙梗培養(yǎng)基于30 ℃下培養(yǎng)40 h,每隔4 h取樣1次,測(cè)定煙梗木質(zhì)素含量.

      1.2.5.2 培養(yǎng)溫度

      吸取6 mL種子液加入煙梗培養(yǎng)基中,將接種白腐菌P. chrysosporium后的煙梗培養(yǎng)基分別置于25 ℃,28 ℃,31 ℃,34 ℃,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,測(cè)定煙梗木質(zhì)素含量.

      1.2.5.3 接種量 分別吸取2 mL,4 mL,6 mL和8 mL種子液加入煙梗培養(yǎng)基中,接種量為2%,4%,6%和8%,在最適溫度下培養(yǎng)24 h,測(cè)定煙梗木質(zhì)素含量.

      2 結(jié)果與分析

      2.1 菌種馴化結(jié)果

      馴化處理前后煙梗培養(yǎng)基上菌種直徑變化情況見(jiàn)表2.由表2可知,經(jīng)過(guò)適應(yīng)性培養(yǎng)后,白腐菌P. chrysosporium在含有煙梗培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度發(fā)生明顯變化.經(jīng)過(guò)馴化后,白腐菌P. chrysosporium在含0.1 %煙梗的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度顯著提高,不僅延遲期明顯縮短,而且生長(zhǎng)速率加快.馴化前白腐菌P. chrysosporium需要72 h菌絲直徑生長(zhǎng)至1.5 cm,而馴化后只需要24 h直徑就可以達(dá)到相同長(zhǎng)度,培養(yǎng)時(shí)間明顯縮短.因此,經(jīng)過(guò)馴化后的菌種可以在煙梗培養(yǎng)基上較快生長(zhǎng),適合快速處理煙梗以降解其木質(zhì)素.

      2.2 煙梗人工陳化結(jié)果

      經(jīng)過(guò)人工陳化后煙梗的化學(xué)成分會(huì)發(fā)生較大的變化,經(jīng)不同陳化時(shí)間的煙梗,其化學(xué)成分含量的變化見(jiàn)表3.由表3可知,煙梗木質(zhì)素含量隨著陳化時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)下降趨勢(shì).經(jīng)過(guò)3個(gè)月的陳化,煙梗中總糖含量降低14.58%,葡萄糖含量降低17.61%,木質(zhì)素含量降低 21.31%,纖維素含量降低1.44%,有機(jī)酸含量增加7.21%,而煙堿和總氮含量基本沒(méi)有變化.這與隨著人工陳化過(guò)程中煙葉pH值的降低、有機(jī)酸含量逐漸增加[11]的研究結(jié)果一致.說(shuō)明人工陳化過(guò)程中白腐菌P. chrysosporium和煙梗中土著微生物菌群消耗利用掉煙梗中的糖類物質(zhì),同時(shí)木質(zhì)素也有較大程度的降解,人工陳化過(guò)程對(duì)煙梗中各成分發(fā)生較大改變有一定影響.

      2.3 白腐菌P. chrysosporium液體發(fā)酵煙梗木質(zhì)素含量變化情況

      圖1為白腐菌P. chrysosporium發(fā)酵后的煙梗.由圖1可知,利用白腐菌P. chrysosporium液體發(fā)酵煙梗后,煙梗顏色及質(zhì)地發(fā)生一定程度的變化.發(fā)酵24 h,煙梗中的木質(zhì)素降解了19.12%,發(fā)酵40 h后,木質(zhì)素含量進(jìn)一步減少,同原料相比降解了24.26%,但是發(fā)酵40 h煙梗失去了本色.同煙梗人工陳化過(guò)程相比,白腐菌P. chrysosporium發(fā)酵24 h煙梗中木質(zhì)素的含量與人工陳化3個(gè)月相當(dāng),說(shuō)明白腐菌液體發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)對(duì)煙梗中木質(zhì)素的快速降解.

      煙梗的人工陳化和液體發(fā)酵都可以在一定程度上降解煙梗中木質(zhì)素的含量,但是降解效率相差很大.人工陳化過(guò)程中,煙梗在較高的水分含量下會(huì)發(fā)生一定程度的霉變,降低煙梗的實(shí)用性,其間還要防止蟲(chóng)蛀的影響,如果加工不慎就會(huì)出現(xiàn)資源浪費(fèi)的現(xiàn)象.而液體發(fā)酵可以快速降解木質(zhì)素的含量,且發(fā)酵周期較短,故選擇液體發(fā)酵來(lái)降解木質(zhì)素的研究更有價(jià)值.

      2.4 白腐菌P. chrysosporium發(fā)酵煙梗不同條件測(cè)試與優(yōu)選

      白腐菌P. chrysosporium的生長(zhǎng)過(guò)程及產(chǎn)酶條件受到多種環(huán)境條件的影響[5],發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和接種量是影響煙梗中木質(zhì)素降解速率的重要因素,選擇適合的條件進(jìn)行煙梗生物處理,將會(huì)大大提高發(fā)酵效率.

      2.4.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)煙梗木質(zhì)素含量的影響

      發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響煙梗木質(zhì)素的降解速率,在30 ℃,接種量6%條件下,考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)煙梗木質(zhì)素含量的影響,結(jié)果如圖2所示.由圖2可知,煙梗中木質(zhì)素在發(fā)酵過(guò)程的前24 h快速降解,在24 h時(shí)煙梗中木質(zhì)素含量為 2.03%,降解了19.12%,24 h后煙梗中木質(zhì)素含量逐漸趨于平穩(wěn),白腐菌降解木質(zhì)素為次級(jí)代謝反應(yīng)[5],而本研究中白腐菌P. chrysosporium經(jīng)馴化后對(duì)煙梗的降解速率增快,縮短了發(fā)酵時(shí)間.因此,選擇24 h作為最適發(fā)酵時(shí)間.

      2.4.2 發(fā)醇溫度對(duì)煙梗木質(zhì)素含量的影響

      發(fā)酵溫度影響菌種的生長(zhǎng)速率,同時(shí)木質(zhì)素降解酶的活力高低也受到溫度的影響,因此適宜的發(fā)酵溫度是影響木質(zhì)素降解的重要因素.在接種量6%條件下發(fā)酵24 h,考察發(fā)酵溫度對(duì)煙梗中木質(zhì)素含量的影響,結(jié)果如圖3所示.由圖3可知,在低于34 ℃條件下,木質(zhì)素的降解速率隨發(fā)酵溫度的增加而增加,34 ℃下發(fā)酵24 h后,木質(zhì)素含量為1.93%,降解率了23.22%.當(dāng)超過(guò)34 ℃時(shí),由于白腐菌P. chrysosporium生長(zhǎng)受到抑制,煙梗中的木質(zhì)素降解速率下降.因此,選擇最適發(fā)酵溫度為34 ℃.

      2.4.3 接種量對(duì)煙梗木質(zhì)素含量的影響

      在34 ℃條件下發(fā)酵24 h,考察接種量對(duì)煙梗中木質(zhì)素含量的影響,結(jié)果如圖4所示.由圖4可知,在接種量小于6%條件下,隨著接種量的增加,木質(zhì)素的降解速率加快,煙梗中木質(zhì)素含量分別為2.29%,2.14%,1.93%,對(duì)應(yīng)降解率為8.76%,14.74%,23.11%.當(dāng)接種量超過(guò)6%后,木質(zhì)素的降解速率反而有所下降,為22.71%.從節(jié)約成本考慮,選擇適宜的接種量為6%.

      2.5 白腐菌P. chrysosporium液體發(fā)酵后煙?;瘜W(xué)成分變化分析

      在發(fā)酵溫度34 ℃,接種量6%條件下,白腐菌P.chrysosporium發(fā)酵煙梗24 h后,煙梗中化學(xué)成分變化如表4所示.由表4可知,白腐菌液體發(fā)酵后,總糖和葡萄糖含量分別增加 10.84% 和4.86%,這是因?yàn)闊煿0l(fā)酵過(guò)程中微生物需要消耗部分基質(zhì)以供自身生長(zhǎng)需要,即通過(guò)從固形物中降解大分子底物(如纖維素)生成部分糖,因此總糖和葡萄糖含量增加.總糖含量的提高可以在一定程度上消除蛋白質(zhì)燃燒產(chǎn)生的不良?xì)馕?,?duì)煙梗的品質(zhì)起到平衡作用.木質(zhì)素的含量減少23.11%,可明顯降低煙梗在燃燒時(shí)產(chǎn)生的木質(zhì)氣,提高煙草薄片的吸味.總氮和煙堿含量并未發(fā)生明顯變化,有機(jī)酸含量增加,與煙梗人工陳化3個(gè)月時(shí)間化學(xué)成分情況一致.

      3 結(jié)論

      本研究以馴化后的白腐菌P. chrysosporium處理煙梗,利用液體發(fā)酵法降解煙梗中的木質(zhì)素,相較于人工陳化煙梗,白腐菌P. chrysosporium液體發(fā)酵周期短,對(duì)木質(zhì)素的降解率較高.通過(guò)優(yōu)選發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量,確定了P. chrysosporium降解煙梗木質(zhì)素的最適發(fā)酵條件:在34 ℃,6%接種量下發(fā)酵24 h.該條件下液體發(fā)酵煙梗中木質(zhì)素含量為1.93%,降低了23.11%,總糖和葡萄糖含量分別增加10.84%和4.86%,在一定程度上消除了蛋白質(zhì)燃燒產(chǎn)生的不良?xì)馕?,改善了煙梗燃燒時(shí)產(chǎn)生的木質(zhì)氣.本研究可為煙草廢棄物高效生物轉(zhuǎn)化、提升煙梗利用效率、加快煙草副產(chǎn)物資源化綜合利用,提供參考和依據(jù).

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