曾 兵 郭海霞 徐清榜 張曉旻 郭莉莉 萬 野

集落刺激因子1 受體(CSF-1R)是免疫系統(tǒng)中最主要的調(diào)節(jié)因子之一，由原癌基因c-fms 編碼而產(chǎn)生。通過調(diào)節(jié)單核-吞噬譜系細(xì)胞的生成與生物活性來影響腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。在體內(nèi)，CSF-1 通過結(jié)合CSF-1R 后自身磷酸化，并激活其磷酸化激酶域。與此同時，配體、受體結(jié)合形成二聚體形式。然后，效應(yīng)蛋白的酪氨酸殘基磷酸化，引起巨噬細(xì)胞活化。被激活的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)可以通過許多途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，例如促進(jìn)腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤新生血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)分解以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，CSF-1/CSF-1R 也直接影響腫瘤細(xì)胞的生長。目前，已有多種研究表明，CSF-1/CSF-1R 在各種惡性腫瘤中高表達(dá)[1～3]。但遺憾的是，目前仍沒有CSF-1 /CSF-1R 是否影響鼻咽癌進(jìn)展的相關(guān)報道。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR 及Western blot法從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面探討CSF-1R 在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)對細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。筆者希望能為鼻咽癌的診斷及預(yù)后找到一個新的預(yù)測指標(biāo)以及可能成為鼻咽癌患者的治療新靶點(diǎn)。

對象與方法

1.對象：(1)細(xì)胞：5-8F、6-10B 鼻咽癌細(xì)胞株及NP69 永生化正常鼻咽上皮細(xì)胞株購自APTT細(xì)胞庫，CNE-2 鼻咽癌細(xì)胞株由筆者醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心惠贈。5-8F、6-10B、CNE-2 鼻咽癌細(xì)胞株使用RPMI1640 培養(yǎng)基混合10%胎牛血清于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。NP69鼻咽上皮細(xì)胞株使用加入0.05mg/ml BPE 和5ng/ml EGF 的 K-SFM 培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)主要試劑：CSF-1R 兔抗人單克隆抗體(ab61137)購自英國Abcam公司；鼠抗兔多克隆即用型二抗購自中杉金橋公司；免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司；DAB 顯色試劑盒購自中杉金橋公司；南美洲胎牛血清購自美國Gibco公司；RPM1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；K-SFM 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；細(xì)胞總RNA 抽提試劑盒購自天地?fù)P生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天地?fù)P生物科技公司；熒光定量PCR 試劑盒購自天地?fù)P生物科技公司；RIPA 裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所；CSF-1R 兔抗人單克隆抗體購自美國CST 公司；鼠抗兔多克隆抗體購自中山金橋公司；ELC 發(fā)光系統(tǒng)購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測治療前組織標(biāo)本的CSF-1R 蛋白：將切片置于烤片架上放入60℃烤箱中烤片2h。將切片浸泡于二甲苯中脫蠟，15分鐘/次，共3次。然后按從高濃度到低濃度的順序，依次將切片浸泡于梯度乙醇(乙醇濃度依次為：100%、95%、90%、80%、70%)中，每個濃度中均浸泡5min。然后用雙蒸水洗片5分鐘/次，共3次。接著用 PBS 洗片5分鐘/次，共3次。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。每一批次實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置陽性對照片和陰性對照片。已知陽性反應(yīng)標(biāo)本做為陽性對照，與實(shí)驗(yàn)切片采用同種一抗、二抗。PBS 代替一抗作為陰性對照進(jìn)行同步染色。

3.實(shí)時熒光定量PCR檢測：應(yīng)用Primer5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并由Life Technologies 公司合成：CSF-1R:上游引物：5′-TCTGGTCCTATGGCATCCTC-3′，下游引物：5′-GATGCCAGGGTAGGGATTC-3′；Cyclin D1:上游引物，5′-GCGAGATGAGGCGATGGGGC-3′,下游引物：5′-CCTTCAGGGCGGCTGTGGTG-3′；Bcl-2:上游引物：5′-GTGACTTCCGATCAGGAAGG-3′，下游引物:5′-CTTCCAGACATTCGGAGACC-3′；BAX:上游引物：5′-AGTAACATGGAGCTGCAGAGG-3′，下游引物：5′-ATGGTTCTGATCAGTTCCGG-3′；MMP-2:上游引物：5′-ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG-3′，下游引物：5′-CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG-3′；GAPDH:上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。5-8F、6-10B、CNE-2、NP69 4株細(xì)胞分別培養(yǎng)之后使用胰蛋白酶處理制成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞后，取含有約1×106個細(xì)胞的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至RNase-Free 的離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀。其余步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。實(shí)時熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用△△CT 計(jì)算方法，即樣品mRNA 值=2-△△CT?！鰿T=目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值；△△CT=實(shí)驗(yàn)組△CT-對照組△CT。實(shí)驗(yàn)組即5-8F、6-10B、CNE-2 細(xì)胞株；對照組即NP69 細(xì)胞株。

4.Western blot法檢測：5-8F、6-10B、CNE-2、NP69 4株細(xì)胞分別培養(yǎng)約1×106個細(xì)胞后， 用PBS 洗2遍，然后用含有PMSF 的RIPA 裂解液300μl 處理細(xì)胞，吹打數(shù)下，使裂解液充分接觸細(xì)胞，待細(xì)胞充分裂解后，14000×g離心5min，取上清分裝于EP 管中保存于-70℃冰箱內(nèi)。Western blot法實(shí)驗(yàn)條帶采用掃描儀圖像掃描后，用Quantity One 4.6.2 軟件進(jìn)行條帶處理分析。目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。實(shí)驗(yàn)組為5-8F、6-10B、CNE-2 細(xì)胞株；對照組為NP69 細(xì)胞株。

結(jié) 果

1.實(shí)時熒光定量PCR檢測CSF-1R的表達(dá)情況：如圖1、表1所示，發(fā)現(xiàn)5-8F細(xì)胞株中CSF-1RmRNA的表達(dá)明顯高于NP69細(xì)胞株(P=0.000)，6-10B細(xì)胞株中CSF-1RmRNA的表達(dá)明顯低于NP69細(xì)胞株(P=0.000)，CNE-2細(xì)胞株中CSF-1RmRNA的表達(dá)水平略高于NP69細(xì)胞株，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.057)。

圖1 實(shí)時熒光定量PCR檢測

表1 5-8F、6-10B、CNE-2及NP69細(xì)胞株中CSF-1RmRNA的相對表達(dá)水平

2.Western blot法檢測CSF-1R的表達(dá)情況：如表2所示，發(fā)現(xiàn)僅5-8F鼻咽癌細(xì)胞株中CSF-1R蛋白表達(dá)陽性，6-10B(P=0.370)、CNE-2(P=0.480)鼻咽癌細(xì)胞株及NP69正常鼻咽上皮細(xì)胞株中CSF-1R蛋白表達(dá)均為陰性(圖2)。5-8F細(xì)胞株相對于NP69細(xì)胞株明顯呈現(xiàn)CSF-1R蛋白高表達(dá)(P=0.007)。

表2 CSF-1R在5-8F、6-10B、CNE-2及NP69細(xì)胞株中的相對表達(dá)量比較

圖2 Western blot法檢測結(jié)果

3.CSF-1R與細(xì)胞增殖因子CyclinD1、凋亡因子Bcl-2及BAX、侵襲轉(zhuǎn)移因子MMP-2的相關(guān)性：如表3所示，發(fā)現(xiàn)5-8F細(xì)胞株中CyclinD1mRNA的表達(dá)水平均顯著高于6-10B細(xì)胞株(P=0.000)。5-8F細(xì)胞株中表達(dá)的Bcl-2mRNA顯著高于6-10B細(xì)胞株(P=0.000)，BAXmRNA顯著低于6-10B細(xì)胞株(P=0.000)，Bcl-2mRNA/BAXmRNA比值顯著高于6-10B細(xì)胞株(P=0.000)。5-8F細(xì)胞株中MMP-2mRNA的表達(dá)水平顯著高于6-10B細(xì)胞株(P=0.000)。

表3 5-8F與6-10B細(xì)胞株中CyclinD1、Bcl-2、BAX、MMP-2mRNA的表達(dá)水平對比 (n=10)

討 論

CSF-1是由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等非造血細(xì)胞合成分泌的一個負(fù)責(zé)激活巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖、分化的重要的生長因子。它通過結(jié)合其受體CSF-1R，促進(jìn)細(xì)胞外結(jié)合域構(gòu)象的改變，使得其相鄰受體細(xì)胞間的交互作用更穩(wěn)定，從而形成二聚體。同時促進(jìn)二聚體細(xì)胞質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)一步調(diào)節(jié)其效應(yīng)細(xì)胞的生長、成熟，激活相應(yīng)的靶細(xì)胞，多方面協(xié)同效應(yīng)促進(jìn)腫瘤進(jìn)一步發(fā)展[4]。研究發(fā)現(xiàn)CSF-1R在頭頸部腫瘤中表達(dá)異常增高，并且在結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)CSF-1R表達(dá)高于正常組織[5]。然而，到目前為止，據(jù)筆者查閱文獻(xiàn)，本研究首次提出了CSF-1R在鼻咽癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)水平。并且筆者從多個角度證明了這種高水平的表達(dá)與鼻咽癌的預(yù)后有一定的關(guān)聯(lián)性。CSF-1R主要表達(dá)在鼻咽癌腫瘤組織細(xì)胞的核膜上，其次在細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CSF-1R在鼻咽癌中明顯高表達(dá)(P=0.000)。但Sabitha Aligeti等研究顯示當(dāng)內(nèi)源性的CSF-1/CSF-1R過度表達(dá)時，卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力、附著力，以及能動性增加，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的概率大大增加[6]。

通過實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-8F細(xì)胞株中CSF-1R在基因水平和蛋白水平均顯著高表達(dá)(P=0.000、P=0.007)，而6-10B細(xì)胞株中CSF-1R在基因水平明顯低表達(dá)(P=0.000)，但蛋白水平與NP69正常鼻咽上皮細(xì)胞株一樣均顯示為陰性表達(dá)(P=0.370)。說明6-10B不論是在基因水平，還是在蛋白水平均表現(xiàn)為CSF-1R低表達(dá)狀態(tài)。此外，CNE-2細(xì)胞株中CSF-1R在基因和蛋白水平的表達(dá)呈現(xiàn)與NP69差別不大(P=0.057、P=0.481)。因此，筆者選取CSF-1R高表達(dá)細(xì)胞株5-8F和CSF-1R低表達(dá)細(xì)胞株6-10B進(jìn)行進(jìn)一步研究。CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化的周期素。當(dāng)CyclinD1基因擴(kuò)增時，細(xì)胞增殖周期將失調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，CSF-1R高表達(dá)細(xì)胞株5-8F中CyclinD1的表達(dá)水平明顯高于CSF-1R低表達(dá)細(xì)胞株6-10B(P=0.000)，說明5-8F鼻咽癌細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于6-10B。Bcl-2抗凋亡蛋白和Bax促凋亡蛋白在鼻咽癌細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起到了重要作用。鼻咽癌細(xì)胞中，Bcl-2存在于細(xì)胞線粒體上，通過改變線粒體膜的通透性阻止細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。Bax則通過與線粒體膜上Bcl-2結(jié)合形成同源二聚體，參與構(gòu)成跨線粒體膜的孔道蛋白，從而降低跨膜電位引導(dǎo)細(xì)胞色素C的外流引起細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bax表達(dá)的平衡直接決定細(xì)胞是否凋亡，因此，Bcl-2與Bax的比率(Bcl-2/Bax)是臨床腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物之一[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)相對于細(xì)胞株6-10B細(xì)胞株，5-8F中凋亡因子Bcl-2明顯高表達(dá)、Bax明顯低表達(dá)(P=0.000、P=0.000)。5-8F細(xì)胞株中Bcl-2/Bax高于6-10B細(xì)胞株(P=0.000)。換句話說CSF-1R高表達(dá)細(xì)胞株5-8F的凋亡水平低于CSF-1R低表達(dá)細(xì)胞株6-10B。腫瘤從原發(fā)灶向周圍組織侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，必須先降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜，而基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族在這一過程中起到了重要作用。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族中降解Ⅳ型膠原最主要的酶之一。在多種腫瘤如頭頸組織、肺、乳腺、前列腺、直腸等的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用[8～11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，5-8F細(xì)胞株中MMP-2侵襲轉(zhuǎn)移因子表達(dá)水平明顯高于CSF-1R低表達(dá)細(xì)胞株6-10B細(xì)胞株(P=0.000)，說明5-8F細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)于6-10B細(xì)胞。通過將CSF-1R高表達(dá)細(xì)胞株5-8F和CSF-1R低表達(dá)細(xì)胞株6-10B中CyclinD1、Bcl-2/Bax、MMP-2的表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CSF-1R高表達(dá)細(xì)胞株5-8F的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，而細(xì)胞凋亡能力則較弱。由此，筆者預(yù)測CSF-1R高表達(dá)的鼻咽癌患者更容易發(fā)生腫瘤進(jìn)展，預(yù)后更差。這一結(jié)果正好與鼻咽癌組織免疫組化的結(jié)果相吻合。雖然CSF-1R高表達(dá)誘導(dǎo)鼻咽癌進(jìn)展的具體機(jī)制尚不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。但就目前了解的資料來看，這可能與CSF-1/CSF-1R依賴性的巨噬細(xì)胞異常活躍有關(guān)[12]。其他腫瘤研究的證據(jù)也支持筆者此觀點(diǎn)。Allavena等[13]在骨肉瘤小鼠模型中的研究表明，CSF-1/CSF-1R過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化和功能的激活，從而促進(jìn)腫瘤快速進(jìn)展且預(yù)后較差[14，15]。因此，筆者預(yù)測在不遠(yuǎn)的將來CSF-1R或許成為鼻咽癌診療的一個潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，鼻咽癌細(xì)胞與正常鼻上皮細(xì)胞株之間CSF-1R的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CSF-1R的表達(dá)與細(xì)胞增殖因子CyclinD1、凋亡因子Bcl-2及BAX、侵襲轉(zhuǎn)移因子MMP-2的表達(dá)有一定的相關(guān)性，CSF-1R表達(dá)水平越高，細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，凋亡能力越弱。