何鳳琴，向全麗，屈庚超，周登祥

(西安文理學院生物與環(huán)境工程學院，西安市秦嶺天然產(chǎn)物開發(fā)與抗癌類創(chuàng)新藥物研究重點實驗室，基因工程實驗室，陜西 西安 710065)

絕大多數(shù)研究都是母嬰分離對嬰兒成年后行為的影響，然而，對于大多數(shù)的母性而言，與自己的嬰兒互動是一個大有裨益和愉快的經(jīng)歷，可促進母嬰依戀，不僅能夠確保對發(fā)育中的嬰兒最佳照顧，使嬰兒得以健康生長，而且也能夠激發(fā)母性獎賞系統(tǒng)，使母性產(chǎn)生愉悅的情緒，對生理健康產(chǎn)生積極效應(yīng)[1]。產(chǎn)后抑郁癥剝奪了母性與孩子一起共享天倫的樂趣，而這一疾病的發(fā)生是與女性生產(chǎn)之后體內(nèi)性激素的變化有關(guān)。

雌激素是一種情緒調(diào)節(jié)劑，雌激素受體β (estrogen receptor β，ERβ)分布在與情緒相關(guān)的腦區(qū)，如杏仁內(nèi)側(cè)核(medial amygdaloid nucleus, MeA)，終紋床核(bed nucleus of the stria terminalis，BNST)，中視前區(qū)(medial preoptic area，mPOA)，雌激素在這些腦區(qū)通過受體對個體情緒產(chǎn)生重要影響[2]。大豆異黃酮(soy isoflavones)是大豆在生長發(fā)育過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，它們的化學結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素相似性，具有類雌激素作用，植物雌激素的雌激素活性取決于它們與雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)或β的相互作用。在一定劑量下，植物雌激素可以選擇性地與ERβ相互作用，從而影響ERβ的表達[3]。一些研究認為大豆異黃酮可作為一種治療藥物用于緩解與絕經(jīng)相關(guān)的生理和情緒變化，但另有一些研究認為大豆異黃酮對不同時期不同性別社會性行為影響不一致。通過對嚙齒動物研究表明終生攝入大豆可導致抗焦慮作用[4]，也有研究表明，大豆異黃酮可以減少抑郁相關(guān)的行為取決于大豆異黃酮飲入開始時的年齡和卵巢狀態(tài)的變化[5]。然而異黃酮類分子如何調(diào)節(jié)大腦對抑郁樣行為影響機制還不清楚。本文以C57BL/6J小鼠為研究對象，通過產(chǎn)后母嬰長期分離使母鼠發(fā)生情緒變化，通過強迫游泳(Forced swimming test ，F(xiàn)ST) 和懸尾實驗(Tail suspension test, TST)進行行為測試。通過對具有抑郁樣行為母鼠食用一定時間的大豆異黃酮，探討異黃酮類分子如何調(diào)節(jié)大腦對抑郁樣行為影響的ERβ機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雌、雄C57BL/6J小鼠60只，體重28～33 g，由西安文理學院動物中心提供，購于西安交通大學醫(yī)學院動物研究所。雌雄配對合籠放置于塑料鼠箱中(30 cm×20 cm×15 cm)，飼養(yǎng)于本實驗室鼠房，保持室溫 20～25℃和自然光周期 12L∶12D 。飼喂鼠飼料。飼養(yǎng)籠以鋸木作底物，棉花作巢材，正常撫養(yǎng)1 d后開始實驗。

1.2 材料和設(shè)備

大豆異黃酮(HPLC ≥ 98%)購自上海信裕生物科技有限公司；雌激素Elisa試劑盒(CEA461Ge)和多巴胺Elisa試劑盒(CEA851Ge)購自美國Meridian公司；一抗兔抗ERβ ( Sc28974) 購自美國Santa cruz；二抗(羊抗兔) 和SABC(鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物) 購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB 為Sigma 分裝。強迫游泳和懸尾實驗設(shè)備購自深圳瑞沃德生物科技有限公司，酶標儀(Bio-Tek，Winooski)購自美國，冰凍切片機(CM1950)購自德國萊卡公司，尼康顯微鏡及尼康相機購自日本東京。

1.3 動物分組

將產(chǎn)后2 d母鼠隨機分為2 組，對照組(n=10)和長期分離模型組(n=40)，對照組不給予任何刺激，長期分離模型組母鼠給予從分娩第2日到第10日，母嬰每天8:00-11:00分離3 h的刺激，分離后再放回鼠籠繼續(xù)撫養(yǎng)后代。第11日通過母鼠強迫游泳和懸尾實驗中掙扎的時間、頻次和靜止的時間、頻次檢測行為學指標以判斷造模是否成功。

1.4 實驗分組

將沒有造模成功的10只母鼠排除，造模成功母鼠分成3組，加上對照組，共四組，分別是：(1)對照組(Control，n=10)：正常飲食，正常撫育后代；(2)模型組(Model，n=10)：從第12日每日早上用蒸餾水0.3 ml連續(xù)灌胃到21 d，共10 d，期間母嬰不分離；(3)低濃度組(Low dose，n=10): 從第12日每日早上用15 mg/kg·d-1大豆異黃酮溶液0.3 ml連續(xù)灌胃到21 d，共10 d，期間母嬰不分離；(4)高濃度組(High dose，n=10)：從第12日每日早上用30 mg/kg·d-1大豆異黃酮溶液0.3 ml連續(xù)灌胃到21 d，共10 d，期間母嬰不分離。隨著灌胃天數(shù)的增加，觀察到高濃度組母鼠對幼鼠的撫育時間逐漸延長。灌胃24 h后，對母鼠進行行為學實驗。

1.5 強迫游泳實驗(forced swimming test, FST)

將母鼠放入高20 cm，直徑15 cm的透明圓柱形玻璃缸中，保持水溫37℃，先適應(yīng)環(huán)境1 min后，再實驗并記錄5 min，利用smart v.3.0軟件記錄分析掙扎的時間、頻次和靜止的時間、頻次。

1.6 懸尾實驗(tail suspension test, TST)

將母鼠尾部固定，倒懸身體。將攝像設(shè)備放置在母鼠的正前方，先適應(yīng)1 min后，再實驗并記錄5 min，利用smart v.3.0軟件分析掙扎的時間、頻次和靜止的時間、頻次。

1.7 Elisa測定血清雌二醇(estradiol，E2)和多巴胺(dopamine，DA)

行為實驗2 d后，在8:00-10:00之間，從麻醉的母鼠眼眶后竇收集血液(戊巴比妥鈉劑量為4 mg/kg體重)。血清樣本在室溫下以606 g的相對離心力(RCF)離心10 min將血清與血細胞分離，棄去血細胞，血清在-80℃冰箱儲存。E2和DA濃度使用Elisa試劑盒測定。首先，將制備的樣品和標準品分別放入板皿中，在37℃下溫育30 min。其次，用洗滌溶液洗滌平板皿四次，加入辣根過氧化物酶(HRP)- 混合劑在37℃溫育30 min。最后，在將培養(yǎng)皿洗滌四次后，培養(yǎng)皿浸入彩色顯影劑A和B中，在37℃溫育15 min后，反應(yīng)被終止液停止。使用酶標儀在450 nm下測量光密度，并將空白設(shè)定為零。重復(fù)值之間的差異小于5%。

1.8 免疫組化檢測部分腦區(qū)ERβ

收集血清后，由左心室注入0.1 mol PBS 150 ml，同時右心房放血，灌注4 %多聚甲醛300 ml 進行前固定，小心取腦入4 %多聚甲醛后固定3 h (4℃) ，再浸入30 %的蔗糖溶液過夜待沉底。OCT 冰凍包埋劑包埋后冰凍切片，切片厚40 μm。切片首先在正常羊血清37 ℃孵育15 min 進行封閉，然后入一抗ERβ(1∶100)，4℃孵育72 h，0.01 mol PBS沖洗3次，每次3 min，再分別于二抗和SABC 中37℃孵育30 min，0.01 mol PBS 沖洗3次，每次3 min，滴加DAB 顯色劑顯色10～30 min后在0.01 mol PBS中漂洗后貼片，風干，梯度酒精中脫水，封片。用0.01 mol PBS代替一抗ERβ作為陰性對照，其他實驗步驟同上。

在定量分析之前，將制好的玻片隨機編號，由不知實驗方案的實驗員分析。使用網(wǎng)格隨機在(200×200 μm2)標準面積下采樣，用眼定量數(shù)免疫反應(yīng)細胞的數(shù)量。ERβ-免疫反應(yīng)細胞數(shù)(ERβ-immunoreactive neurons，ERβ-IRs) 在MeA，BNST和mPOA的 200×200 μm2的區(qū)域中計算。選擇這些大腦區(qū)域是因為在MeA，BNST，mPOA中發(fā)現(xiàn)了大量ERβ，并且與情緒活動有關(guān)[6]。根據(jù)尼氏染色和小鼠腦立體定位圖集確定確定三個腦區(qū)位置[7]。

對于每個腦區(qū)，從前到后選擇三個代表性切片，通過計數(shù)陽性神經(jīng)元(棕黃色點狀，核染色)獲得每個動物的平均值。所有免疫組化過程也包括未添加一抗的陰性對照。用連接到尼康顯微鏡的尼康相機對選擇部分進行拍攝。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大豆異黃酮對母鼠在FST和TST中的影響

與對照組比較，模型組和低濃度組在強迫游泳和懸尾實驗中，運動時間和頻次明顯降低(P<0.05或P<0.01)，模型組不動時間和頻率明顯升高(P<0.05或P<0.01)，低濃度組除了不動頻次沒有明顯差異外(P>0.05)，不動時間也明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而高濃度組則無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與模型組比較，低濃度組除了在強迫游泳和懸尾實驗中運動時間顯著升高(P<0.05)，在強迫游泳不動時間顯著性降低(P<0.05)，在懸尾實驗中不動頻次明顯降低外(P< 0.01)，其他無顯著性差異(P>0.05)，而高濃度組在強迫游泳和懸尾實驗中運動時間和頻次均明顯升高(P<0.05或P< 0.01)，不動時間和頻次均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與低濃度組比較，高濃度組在強迫游泳和懸尾實驗中運動時間和頻次均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，在強迫游泳中不動時間明顯降低(P<0.01)，其他無顯著性差異(P>0.05，表1，表2) 。表明長期分離導致母鼠產(chǎn)生產(chǎn)后抑郁樣行為，大豆異黃酮可減少母鼠的抑郁樣行為，較高濃度的大豆異黃酮減少的更為明顯。

Tab. 1 Effects of soy isoflavones on female mice in FST n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△△P<0.01vsthe low dose group

Tab. 2 Effects of soy isoflavones on female mice in TST n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△P<0.05,△△P<0.01vsthe low dose group

2.2 大豆異黃酮對母鼠血清E2和DA的影響

在ELISA實驗中，與對照組比較，模型組、低濃度組和高濃度組血清中E2濃度明顯降低(P<0.01)，且三組之間無顯著性差異(P>0.05)；然而，大豆異黃酮可使母鼠DA的水平增加，表現(xiàn)為與對照組比較，模型組和低濃度組明顯降低(P<0.01)，而高濃度組無明顯差異(P>0.05)；與模型組和低濃度組比較，高濃度組DA水平明顯增加(P<0.01)，模型組和低濃度組之間無顯著性差異(P>0.05，表3)。表明具有抑郁樣行為母鼠血清中雌二醇明顯減少，大豆異黃酮并未使血清中雌二醇增加，較高濃度的大豆異黃酮使 DA增加明顯。

2.3 大豆異黃酮對母鼠ERβ表達的影響

大豆異黃酮對ERβ-IRs有重要影響。與對照組比較，ERβ-IRs在模型組和低濃度組MeA，BNST和mPOA明顯降低(P<0.05或P<0.01)，在高濃度組這三個腦區(qū)均無顯著性差異(P>0.05)；與模型組比較，除低濃度組在mPOA顯著性多外(P<0.05)，其他兩個腦區(qū)無顯著性差異(P>0.05)，高濃度組MeA，BNST和mPOA均顯著多于模型組(P<0.01)；與低濃度組比較，高濃度組MeA(P<0.05)，BNST(P<0.01)和mPOA(P<0.01)均顯著多于低濃度組(圖1，表4)。表明具有抑郁樣行為母鼠ERβ在腦區(qū)明顯減少，大豆異黃酮使抑郁樣行為母鼠腦區(qū)ERβ明顯增加，較高濃度的大豆異黃酮使ERβ增加更明顯。

GroupE2 DAControl1339.91±29.4879.76±4.63Model 800.37±259.23??20.78±3.76??Low dose749.37±263.56??30.64±4.56??High dose700.23±236.21??67.83±8.23##△△

E2： Estradiol; DA: Dopamine

**P<0.01vsthe control group;##P<0.01vsthe model group;△△P<0.01vsthe low dose group

Fig. 1 Effects of soy isoflavones on the expression of ERβ in female mice(×200)

MeA: Medial amygdaloid nucleus; BNST: Bed nucleus of the stria terminalis; mPOA: Medial preoptic area

Group MeA BNST mPOAControl42.24±3.5933.57±4.2345.26±4.13Model20.36±2.6??20.12±2.62?20.31±2.15??Low dose24.26±3.57?22.24±2.42?32.22±3.15??#High dose44.57±5.12##△34.13±3.57##△△43.13±3.59##△△

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe model group;△P<0.05,△△P<0.01vsthe low dose group

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)具有抑郁樣行為的母鼠連續(xù)灌胃10 d高濃度大豆異黃酮時，在強迫游泳和懸尾實驗中活動持續(xù)時間和頻次明顯高于模型組，與情緒相關(guān)的腦區(qū)MeA，BNST和mPOA ERβ明顯升高，血清中DA明顯升高。表明母嬰分離加重了產(chǎn)婦的負面情緒，產(chǎn)生較高程度的抑郁樣行為，而較高濃度的大豆異黃酮能夠減少抑郁樣行為與大豆異黃酮使血清中DA升高，腦區(qū)ERβ增加有關(guān)，且抑郁樣行為的減少與大豆異黃酮濃度有相關(guān)性。

母鼠撫育子代10 d后與子代和雄鼠長期分離，母鼠表現(xiàn)明顯的抑郁樣行為，即出現(xiàn)產(chǎn)后抑郁，與他人的研究結(jié)果相似：在大鼠，產(chǎn)后每天分離3 h，母鼠在強迫游泳實驗中表現(xiàn)為抑郁樣行為[8]。母嬰構(gòu)成不可分割二聚體[8]，母親和同窩仔鼠構(gòu)成個體社會環(huán)境的重要成分，提供如營養(yǎng)、熱量、軀體感覺、動覺、嗅覺及聽覺刺激等重要資源。母嬰長期分離，不僅對幼鼠代表嚴重的環(huán)境剝奪[9]，同時對母鼠也是嚴重的環(huán)境剝奪，母鼠表現(xiàn)出焦慮甚至抑郁樣行為，這些行為變化與控制母體行為的大腦區(qū)域的神經(jīng)化學物質(zhì)的改變有關(guān)，本實驗就證明母鼠產(chǎn)生的抑郁樣行為與血清中E2水平及腦區(qū)MeA，BNST和mPOA的ERβ明顯下降有關(guān)，這一結(jié)果也與他人的研究結(jié)果一致：產(chǎn)后抑郁組雌激素下降值明顯高于對照組[10]。他人和我們前期研究已經(jīng)證實MeA，BNST和mPOA是調(diào)節(jié)抑郁等情緒相關(guān)的腦區(qū)[6]，E2可以和這些腦區(qū)的ERβ直接結(jié)合，發(fā)揮調(diào)整抑郁樣行為的作用。給予卵巢切除的大鼠注射E2，E2可通過與腦區(qū)ERβ受體結(jié)合而發(fā)揮抗抑郁作用[11]。母子的長期分離導致E2和ERβ降低，可能與母嬰分離的應(yīng)激誘發(fā)的應(yīng)激激素過度分泌，抑制垂體促性腺激素分泌，降低性激素合成酶活性，進而抑制卵巢產(chǎn)生性激素有關(guān)[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)長期分離使血清中DA水平顯著低于對照組，這與酈錚錚等研究結(jié)果相似[12]。DA是產(chǎn)生欣快感的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與獎賞和情緒控制有關(guān)，DA 系統(tǒng)參與情緒相關(guān)的調(diào)控，它是調(diào)解情緒神經(jīng)回路中的關(guān)鍵因素[13]。雌激素可在垂體、下丘腦、黑質(zhì)一紋狀體和中腦邊緣系統(tǒng)等水平影響DA 能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的功能，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)對生殖和非生殖行為的控制，而對中腦邊緣系統(tǒng)DA的調(diào)節(jié)，可能在心理障礙發(fā)生中起重要作用[14]。本次實驗具有抑郁樣行為的模型組E2水平下降，DA也下降進一步證實了內(nèi)源性雌激素水平對中腦邊緣系統(tǒng)DA活性的調(diào)節(jié)作用。雌激素可作用于DA 轉(zhuǎn)運體上的特殊位點減少轉(zhuǎn)運，也可直接或間接影響D2DA自身受體，使自身受體親合力下降，最終抑制重攝取，減少清除率，增加DA釋放量[14]。

令人感興趣的是，雖然母鼠撫育子代10 d后與子代和雄鼠分離，但是經(jīng)過連續(xù)灌胃10 d大豆異黃酮，特別是高濃度組，母鼠在懸尾實驗中運動時間和頻次明顯高于模型組和低濃度組，尤其是在強迫游泳實驗中與這兩組差別極大，一方面說明大豆異黃酮可能使抑郁樣行為明顯減少，另一方面也可能是與大豆異黃酮對運動小鼠能量代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[15]。低和高濃度組血清中的E2比模型組降低，但無統(tǒng)計學意義，表明15或30 mg/kg·d-1大豆異黃酮溶液對E2有一定的抑制作用，這種趨勢與劉兆平等[16]以及周志軍等[17]報道的大豆異黃酮能顯著增加大鼠血清中E2的研究結(jié)果相反，但與盛微等報道的相似[18]。這可能是由于大豆異黃酮是一種與E2結(jié)構(gòu)相似的植物性雌激素，它能與C57BL/6J母鼠體內(nèi)E2受體競爭性結(jié)合，從而反饋性調(diào)節(jié)，導致母鼠體內(nèi)E2濃度降低[19]。雖然灌胃大豆異黃酮使血清中的E2比對照組降低，但MeA，BNST和mPOA ERβ明顯升高，可能大豆異黃酮進入機體后與雌激素受體ERβ相結(jié)合并刺激ERβ的轉(zhuǎn)錄表達，從而ERβ的數(shù)量增加并調(diào)節(jié)動物的行為[20]，使抑郁樣行為減少。

在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)連續(xù)灌胃10 d大豆異黃酮，主要是高濃度組血清中的DA也明顯增多，可能與大豆異黃酮可在中樞發(fā)揮類雌激素作用，通過腦內(nèi)經(jīng)典的核內(nèi)受體或膜甾類受體對 DA的功能活動發(fā)揮著基因組和非基因組的調(diào)節(jié)作用，使杏仁核DA能神經(jīng)元釋放增多[14]，對于本實驗中大豆異黃酮對雌鼠 DA 釋放調(diào)節(jié)的具體機制還有待于進一步的研究。