馮玲

摘要：本實(shí)驗(yàn)研究了透明質(zhì)酸鈉溶液和糜蛋白酶溶液相互作用的共振瑞利散射光譜，其最大散射峰為300nm，RRS的強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與透明質(zhì)酸鈉溶液濃度呈良好的線性關(guān)系，本文同時(shí)討論了實(shí)驗(yàn)適宜的反應(yīng)條件以及共存物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示該方法具有較好的靈敏度，且有較好選擇性，從而建立一種測(cè)定透明質(zhì)酸鈉的新方法。該方法測(cè)定滴眼液中透明質(zhì)酸鈉的含量，效果較好。

關(guān)鍵詞：糜蛋白酶；共振瑞利散射；透明質(zhì)酸鈉

透明質(zhì)酸鈉（Sodium hyaluronate，以下簡稱SH）可從雞冠中提取或通過乳酸球菌發(fā)酵獲得，SH是一種白色粉末狀固體，有時(shí)也呈纖維狀，具有較好的保濕性，能溶于水，不溶于乙醚、丙酮和乙醇等有機(jī)溶劑，無臭味，干燥時(shí)，氮含量為2.8%～4.0%，葡糖醛酸含量為37.0%～51.0%。是一種鏈狀的天然高分子多糖類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)式如下：

以前在測(cè)定透明質(zhì)酸鈉的方法上都有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，本實(shí)驗(yàn)擬采用共振瑞利散射法對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)行測(cè)定，來建立一種更為高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。共振瑞利散射有如下的優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)稀溶液可進(jìn)行測(cè)定，且靈敏度較高；②可操作性強(qiáng)，同時(shí)對(duì)RRS光譜的特征亦可進(jìn)行研究。因其有較高的信號(hào)水平，可采用普通熒光光度計(jì)的普通光源作為發(fā)射光源，使普通光源通過單色器，形成波長連續(xù)的入射光，再經(jīng)由普通熒光分光光度計(jì)同步掃描即可得到清晰完整的RRS光譜。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中使用普通的熒光分光光度計(jì)即可得到測(cè)定物質(zhì)的RRS光譜，由于使用儀器的廉價(jià)，對(duì)該技術(shù)的普及使用也更加容易。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

日立F-2700型熒光分光光度計(jì)， 測(cè)定參數(shù)：狹縫5 nm；PHS-3C型精密PH計(jì)，校正溶液PH值。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

配制0.4 mg/mL的透明質(zhì)酸鈉溶液。糜蛋白酶溶液：采用100 μg/mL的樣品。BR緩沖溶液：將0.04 mol/L H3PO4，H3BO3和CH3COOH混合一定比例的0.2 mol/L NaOH溶液，得到不同PH值的BR緩沖溶液，通過酸度計(jì)得出其PH值。該實(shí)驗(yàn)使用的其余試劑濃度均達(dá)到分析純標(biāo)準(zhǔn)，使用二次蒸餾水作為實(shí)驗(yàn)用水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將PH=3.3的BR緩沖溶液1.0 mL、Chy溶液0.6 mL以及一定量的SH標(biāo)準(zhǔn)溶液加入10 mL的比色管中混合均勻，稀釋至刻度后再搖勻。靜置10 min后，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行同步掃描（λex=λem）同時(shí)記錄以各自最大散射波長處測(cè)定樣品的共振瑞利散射光譜IRRS和試劑空白散射強(qiáng)度的共振瑞利散射光譜I0RRS，?IRRS=IRRS-I0RRS。

2 結(jié)果與討論

光譜特征

RRS光譜

以△λ=0 nm分別掃描SH溶液、Chy溶液以及SH-Chy體系溶液，得RRS光譜圖。通過觀察并分析光譜圖可得：單獨(dú)的SH溶液和Chy溶液其共振瑞利散射強(qiáng)度都很微弱，但當(dāng)兩者混合后，相互作用形成復(fù)合物時(shí)，共振瑞利散射強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，并在300 nm處產(chǎn)生一個(gè)清晰的散射峰。

通過研究不同濃度的SH溶液對(duì)Chy-SH體系RRS強(qiáng)度的影響，得到RRS光譜。從光譜圖可知：當(dāng)SH concentration的濃度在0～1.0 μg/mL范圍內(nèi)遞增時(shí)，Chy-SH體系的RRS強(qiáng)度在300 nm處依次增強(qiáng)，呈良好的線性關(guān)系。

適宜的反應(yīng)條件

（1）酸度的影響。分別試驗(yàn)了BR、HAc-NaAc等緩沖溶液對(duì)SH-Chy體系的影響，結(jié)果顯示BR緩沖液對(duì)體系的測(cè)定最佳，進(jìn)一步優(yōu)化BR緩沖液在不同PH值對(duì)該體系的影響。通過進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可知，當(dāng)溶液PH在2.8～4.8時(shí)該體系的共振瑞利散射光譜的差值最大，本實(shí)驗(yàn)選取PH=3.3的BR緩沖液1.0 mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（2）糜蛋白酶濃度的影響。從結(jié)果可以看出Chy與SH反應(yīng)在Chy濃度5.0～15 μg/mL時(shí)，Chy-SH體系的散射強(qiáng)度達(dá)到最大，以下實(shí)驗(yàn)選用Chy濃度為6.0 μg/mL。

反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性

在上述的實(shí)驗(yàn)條件和室溫下，考察了時(shí)間及該體系的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10 min內(nèi)Chy溶液與SH溶液可完全反應(yīng)，且在1h內(nèi)其DIRRS的值較為穩(wěn)定，所以當(dāng)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)10 min后再進(jìn)行測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線

選擇最佳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件，分別將不同濃度的SH溶液與Chy溶液進(jìn)行混合，并在其最大波長處測(cè)定RRS的強(qiáng)度，通過使用該體系散射增強(qiáng)后的ΔIRRS值進(jìn)行繪制透明質(zhì)酸鈉濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法對(duì)透明質(zhì)酸鈉的測(cè)定靈敏度較高、檢出限較好，其檢出限為4.33 ng/mL。

方法的選擇性

實(shí)驗(yàn)研究了共存金屬離子、無機(jī)酸根、糖類、氨基酸等對(duì)該體系的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以上物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)該體系不造成影響，該方法具有良好的選擇性。

3 分析應(yīng)用

在10 mL比色管中加入稀釋后濃度為1.0 mL（0.01 mg/mL）的透明質(zhì)酸鈉滴眼液，在最佳條件下對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，再向其中加入標(biāo)準(zhǔn)的透明質(zhì)酸鈉溶液來檢驗(yàn)該方法的回收率。分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)從而得出該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)考察了透明質(zhì)酸鈉溶液與糜蛋白酶溶液混合體系的共振瑞利散射光譜，建立了一種測(cè)定透明質(zhì)酸鈉的新方法，該方法應(yīng)用于滴眼液中透明質(zhì)酸鈉含量的測(cè)定結(jié)果較好，令人滿意。

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（作者單位：四川省南充市高坪第七小學(xué)江東校區(qū)）