miR-17-92通過靶向抑制QKI促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

肖慧敏，柳青峰，臧輝，肖明明，孫田，褚飛，祖富強(qiáng)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是當(dāng)今世界上最常見的惡性腫瘤和導(dǎo)致人類死亡的原因之一，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率較高。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率更是呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅國(guó)人生命健康[1]。結(jié)直腸癌是一個(gè)多基因、多階段、長(zhǎng)期形成的復(fù)雜的病變過程。目前為止，結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制仍未完全明確。近年來對(duì)非編碼基因組序列的研究揭示，微小RNA (MicroRNAs, miRNAs)在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著作用。許多miRNAs存在于結(jié)直腸癌腫瘤組織和血液中, 并對(duì)其發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響[2]。miR-17-92 基因簇是一個(gè)高度保守的基因簇，由6個(gè)miRNA(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a)組成[3]，由于它與多種實(shí)體瘤的發(fā)生密切相關(guān)而受到廣泛關(guān)注。已有研究表明，miR-17-92簇中的6個(gè)miRNA均在CRC腫瘤組織中表達(dá)增加(相比于正常組織)[4]。RNA結(jié)合蛋白QKI蛋白影響細(xì)胞的增殖和組織器官的分化，與其在惡性腫瘤中的作用密切相關(guān)[5]。由RNA結(jié)合蛋白和miRNAs所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控已經(jīng)成為基因調(diào)控的主要方式，對(duì)疾病的演變、癌變的發(fā)生等具有重要意義[6]。本研究通過qRT-PCR、Western blot探討miR-17-92和QKI在結(jié)直腸癌中的表達(dá)關(guān)系，并通過轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞過表達(dá)miR-20a和共轉(zhuǎn)染過表達(dá)QKI，檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，探討miR-17-92和QKI對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，為結(jié)直腸癌的臨床診斷和靶向治療提供新的依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)本來源： 收集2017年1月—2017年12月就診于遼寧省人民醫(yī)院具有完整臨床資料的CRC患者新鮮手術(shù)切除標(biāo)本及新鮮癌旁組織29例，置于液氮中冷凍保存，用于qRT-PCR檢測(cè)。29例患者術(shù)后病理均證實(shí)為腺癌。人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑： QKI兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。RNA分離試劑盒Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR037S)、SYBR Green II實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。miR-20a和內(nèi)參U6的qRT-PCR引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成， miR-20a模擬物、miRNA模擬物陰性對(duì)照均由上海吉瑪公司合成。pCMV6-Myc-DDK、pCMV6-Myc-DDK-QKI(RC205779)均購(gòu)自O(shè)riGene公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2.1 qRT-PCR： 采用RNA分離Trizol試劑盒提取并純化總RNA，根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，均設(shè)立復(fù)孔進(jìn)行重復(fù)。以DEPC水代替模板cDNA作為陰性對(duì)照。反應(yīng)完成后得到標(biāo)本中靶基因的閾值循環(huán)數(shù)(CT)值，與對(duì)應(yīng)U6的CT值相減，得到校正CT值。以正常癌旁組織為對(duì)照，計(jì)算癌組織的相對(duì)表達(dá)值。癌組織/癌旁組織=2-ΔΔct；ΔΔct=(Δct癌組織目的基因-Δct癌組織內(nèi)參基因)-(Δct癌旁組織目的基因-Δct癌旁組織內(nèi)參基因)。

1.2.2 Western Blot： 收集細(xì)胞，PBS 重懸，低溫離心(4℃， 2 000 r/min)5 min,棄去 PBS，干燥潔凈濾紙輕柔吸凈其余液體。用4 ℃預(yù)冷的裂解緩沖液處理胞，冰上25 min，期間反復(fù)混勻裂解液，低溫高速離心(4℃，12 000 r/min)20 min，取其上清液，以提取總蛋白。經(jīng)BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，樣品均定量為同一水平，利用10%的SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印至PVDF膜(提前浸泡甲醇溶液中進(jìn)行膜軟化)。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h。采用ECL發(fā)光方法，并用Bioimaging system采集發(fā)光信號(hào)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)： 用Lipofectamine 3000(美國(guó)Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)試劑說明書進(jìn)行配液及轉(zhuǎn)染或干擾相關(guān)實(shí)驗(yàn)。6 h后采用10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行換液。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，并通過qRT-PCR及Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell 法): SW480轉(zhuǎn)染miR-20a模擬物和QKI過表達(dá)質(zhì)粒后24 h，常規(guī)消化至單個(gè)細(xì)胞，重懸并重新計(jì)算細(xì)胞數(shù)目，調(diào)整單個(gè)的細(xì)胞密度變?yōu)?0×104/ml，取其中的300 μl細(xì)胞懸液用移液器分別加至未鋪有和鋪有基質(zhì)膠的Transwell上室，下室加入600 μl含有20%FBS的新鮮培養(yǎng)基，48 h后，取出小室，棉簽輕輕擦凈Transwell小室上室上層細(xì)胞，冰甲醇固定30 min，棄去冰甲醇，待其揮發(fā)凈后，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗至清潔，晾干，顯微鏡下每孔任意選取3個(gè)200×視野拍照，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用3次以上的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得，符合正態(tài)分布的用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用頻率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。mRNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-20a在腸癌和癌旁組織中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)29例結(jié)直腸癌患者中腸癌組織和癌旁正常組織miR-20a的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在29例患者中25例(86.21%)腺癌組織miR-20a表達(dá)較癌旁組織上調(diào),4例(13.79%)腸癌組織miR-20a表達(dá)較癌旁組織下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.099,P=0.000)。

2.2 QKI蛋白在腸癌和癌旁組織中的表達(dá) Western blot檢測(cè)29例結(jié)直腸癌患者中腸癌組織和癌旁正常組織中QKI蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，23例(79.31%)腺癌組織中QKI蛋白表達(dá)明顯低于癌旁正常組織(t=3.037,P=0.005)，見圖1。

注：N 1-4.癌旁組織； T 1-4.腺癌組織

2.3 miR-20a和QKI蛋白在腸癌和癌旁組織中表達(dá)關(guān)系 Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，miR-20a與QKI蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.437，P=0.018)。

2.4 過表達(dá)miR-20a可下調(diào)QKI蛋白的表達(dá) 在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20a模擬物后，采用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率，采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的QKI蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-20a后，細(xì)胞內(nèi)QKI蛋白表達(dá)顯著減少；在共轉(zhuǎn)染QKI過表達(dá)質(zhì)粒后，QKI蛋白表達(dá)水平有所回升，見圖2、圖3。

2.5 miR-20a和QKI共同影響結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-20a后，SW480細(xì)胞的遷移數(shù)目顯著增多(P<0.05),這種增強(qiáng)作用在共轉(zhuǎn)染QKI過表達(dá)質(zhì)粒后有所減弱，圖4見封3。

注：與Blank、miR-ctrl比較，aP<0.05

3 討 論

微小RNAs是一類長(zhǎng)度為20～25個(gè)核酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，進(jìn)化上高度保守[7-8]。miRNAs本身不翻譯成蛋白質(zhì)[9-10]，在原核、真核生物中主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)[11]，其起作用的方式是與靶基因的mRNA完全或者部分配對(duì)，介導(dǎo)靶基因mRNA直接降解或者抑制其編碼蛋白質(zhì)的翻譯，從而調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移、細(xì)胞調(diào)亡和周期調(diào)控等[12-15]。2004年，miR-17-92基因簇在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中首次被報(bào)道為癌基因[16]。并很快被證實(shí)其作為c-myc的下游，并與E2F轉(zhuǎn)錄網(wǎng)形成自循環(huán)體系，調(diào)控細(xì)胞增殖[17-19]。已有研究證實(shí)，在大腸癌中，miR-17-92基因簇通過抑制E2F1的翻譯促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[20]。本研究證實(shí)miR-17-92基因簇在結(jié)直腸癌組織中較正常結(jié)直腸組織呈高表達(dá)。并通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因可增強(qiáng)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的遷移能力，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。

注：與miR-ctrl比較，aP<0.05；與miR-20a+vec比較，bP<0.05

RNA結(jié)合蛋白QKI是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與RNA活化蛋白(signal transduction and activation of RNA，STAR)家族中的一員，主要包含 QKI-5、QKI-6 和 QKI-7等3個(gè)亞型[21-22]。QKI是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過結(jié)合下游靶分子在轉(zhuǎn)錄后多個(gè)層次對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，如增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性、抑制蛋白的翻譯、調(diào)控mRNA的可變剪接[23-25]。過表達(dá)QKI-5和QKI-6均可以增強(qiáng)內(nèi)源性β-catenin在細(xì)胞膜的表達(dá)水平，降低其在細(xì)胞漿和細(xì)胞核的分布，抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，阻斷Wnt信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的分化[26]。有研究表明，QKI啟動(dòng)子甲基化及QKI mRNA表達(dá)降低可能是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因[27]。另有研究顯示，比對(duì)不同分化水平的直腸癌組織，隨著分化程度的不斷降低而QKI-5的表達(dá)水平也隨之降低，且與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤標(biāo)志物CEA水平密切相關(guān)[28]。本研究證實(shí)QKI在結(jié)直腸癌組織中較正常結(jié)直腸組織呈低表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇與QKI在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。并且通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，利用Western blot檢測(cè)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步揭示了miR-17-92基因簇可通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子QKI，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。為臨床提供了一個(gè)結(jié)直腸癌潛在的診斷和治療靶點(diǎn)。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

肖慧敏：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文撰寫，論文修訂；柳青峰：課題設(shè)計(jì)，論文審核；臧輝、肖明明：提出研究方向、研究思路，論文修訂；孫田、褚飛、祖富強(qiáng)：文獻(xiàn)調(diào)研與整理，論文撰寫