王飛

（邯鄲市中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科, 邯鄲, 056001）

目前，全世界每年約有20 萬例周圍血管移植手術(shù)，自體血管移植是目前最為理想的血管替代物，但自體血管材料來源有限，且血管內(nèi)徑的匹配在移植方面也受限制[1]。隨后有學(xué)者提出采用同種異體血管及組織工程血管來代替自體血管，但同種異體血管移植后會(huì)出現(xiàn)漸進(jìn)性的血管變性及增生異常，導(dǎo)致血管狹窄或閉塞從而使移植失敗[2]。因此，人們把研究方向放在組織工程血管上。

小腸黏膜下層（small intestinal submucosa, SIS）是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)，可通過機(jī)械方法除去小腸肌層和黏膜層，從而獲得一種半透明的膠原基質(zhì)，處理后的SIS 主要由Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成，并含少量Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白，是一種不含細(xì)胞的基質(zhì)材料，由于其具有較好的生物相容性、無免疫原性、可促進(jìn)組織再生、在體降解速度快和機(jī)械強(qiáng)度高等特性，在組織工程材料方面受到廣泛關(guān)注[3]。本實(shí)驗(yàn)主要目的是應(yīng)用SIS 構(gòu)建組織工程血管支架，并對(duì)其復(fù)合內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分析，從而為制備組織工程血管提供前期準(zhǔn)備。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)于2016 年04 月至2017 年04 月在河北省邯鄲市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)選取5 ～6 月齡家豬，取新鮮空腸作為制備SIS 材料，無菌條件取下肢大隱靜脈備用。

2 主要試劑

乙二胺四乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、過氧乙酸和乙醇購自北京化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液和Hoechst33258 購自Solarbio 公司；FDA/PI 購自美國Sigma 公司；鼠來源層粘連蛋白（laminin）抗體和兔來源纖維連接蛋白（fibronectin）抗體購自英國Abcam 公司；山羊抗小鼠IgG/Alexa ?488 和山羊抗兔IgG/TRITC 購自中山金橋生物技術(shù)有限公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基購自康寧公司；100×青霉素/鏈霉素雙抗溶液購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程有限公司。

3 小腸黏膜下層的制備及去抗原性

用生理鹽水反復(fù)沖洗新鮮豬空腸后用無菌帶齒鑷撕下空腸外面的漿膜層、肌層，然后翻轉(zhuǎn)空腸，撕下內(nèi)側(cè)的黏膜層，剩下的組織即為SIS。

將制備好的SIS 膜放入乙二胺四乙酸（100mmol/L）和氫氧化鈉（10mmol/L）的混合溶液中浸潤16h，取出后無菌蒸餾水反復(fù)沖洗，隨后放入鹽酸（1mmol/L）和氯化鈉（1mmol/L）的混合溶液中浸潤8h，取出后無菌蒸餾水再次反復(fù)沖洗。放入PBS 中浸潤16h，再次用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗。隨后放入過氧乙酸（0.1%）和乙醇（20%）的混合溶液中浸潤8h，用含0.05%三氮化鈉的磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)沖洗。將制備好的SIS 冷凍干燥后150Gyγ射線輻照消毒備用。

4 層粘連蛋白和纖維連接蛋白免疫熒光染色

將制備成功的SIS 冰凍切片，丙酮固定后PBS液體洗3 次，3%過氧化氫中避光20min，再次PBS洗3 次后取鼠來源Laminin 抗體和兔來源Fibronectin 抗體各1μl 加入198μl PBS 液中，4℃條件下過夜，隨后加入山羊抗小鼠IgG/Alexa ?488 和山羊抗兔IgG/TRITC，避光孵育2h，熒光顯微鏡下觀察并記錄。

5 大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與擴(kuò)增

無菌條件下切取新鮮豬大隱靜脈，將其浸入含肝素的生理鹽水中反復(fù)沖洗靜脈內(nèi)殘留的血液，隨后用含低分子肝素鈉生理鹽水再次反復(fù)沖洗，直至流出液體清亮為止。用5ml 注射器將約5ml 的0.1%Ⅱ型膠原酶自靜脈的一端注入，管腔充盈后用止血鉗夾住血管兩端，消化30min，隨后用含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)沖洗數(shù)次，以終止消化，并將沖洗液和消化液一同收集入離心管中，以1500r/min 離心3min，棄上清液，再次用含5%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液沖洗、離心、棄上清液。用含10%胎牛血清、1mg/L 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、1mg/L 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的DMEM/F12 培養(yǎng)液沖洗后植入培養(yǎng)瓶中，加入雙抗(青霉素及鏈霉素)10μl。于培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞貼壁后換液，待細(xì)胞生長達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

6 細(xì)胞接種及復(fù)合培養(yǎng)

小腸黏膜下層于培養(yǎng)液中浸泡20min 后平鋪于6 孔板中，取第3 代生長狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS 液體洗3 次后加入0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)后以1×105/cm2的密度接種于小腸黏膜下層材料表面，成功構(gòu)建小腸黏膜下層與內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合體，加入適量含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng)24h。

7 Hoechst33258 染色

將25μg/mL 的Hoechst33258 分別加入至無細(xì)胞接種的SIS 和細(xì)胞接種后的SIS 表面，，常溫孵育5min，丙三醇處理后熒光顯微鏡觀察并記錄。

8 FDA/PI 染色觀察

將六孔板中培養(yǎng)液吸出，向每孔中加入FDA（15μg/mL）80μl 侵染5min，PBS 漂洗，再加入PI（15μg/mL）80μl 侵染5min，PBS 再次漂洗，熒光顯微鏡觀察并記錄。

結(jié) 果

1 體外培養(yǎng)的大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好

倒置相差顯微鏡下觀察，第三代貼壁生長的大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞多呈小三角形，互相鑲嵌排列，細(xì)胞融合達(dá)80%左右，生長狀態(tài)良好（圖1）。

圖1 體外培養(yǎng)大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)正常。比例尺，100μmFig. 1 The morphology of vascular endothelial cells isolated from porcine greatporcine great saphenous vein and cultured in vitro was normal. Scale bar,100μm

2 小腸黏膜下層中的層黏連蛋白及纖維連接蛋白表達(dá)豐富

免疫熒光染色結(jié)果顯示，SIS 中含有較高水平的層黏連蛋白（圖2A）及纖維連接蛋白（圖2B）表達(dá)。

圖2 小腸黏膜下層中的層黏連蛋白(A)及纖維連接蛋白(B)的表達(dá)豐富。比例尺，5000μmFig. 2 High expression of laminin (A) and fibronectin (B) in SIS . Scale bar, 5000μm

3 Hoechst33258 染色顯示內(nèi)皮細(xì)胞種植于小腸黏膜下層后的存活數(shù)量大

Hoechst33258 染色結(jié)果顯示，接種前的SIS 未見明顯細(xì)胞核著色，只有深藍(lán)色背景（圖3A），而在體外培養(yǎng)的大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于SIS 之后，在深藍(lán)色背景上可見數(shù)量較多的呈亮藍(lán)色的細(xì)胞核（圖3B）。

4 FDA/PI 熒光染色顯示種植于小腸黏膜下層支架上的內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好

FDA/PI 熒光染色結(jié)果顯示，在SIS 材料上可見大量呈綠色熒光的活細(xì)胞，以及少量呈紅色熒光的死細(xì)胞，它們均勻分布，表明內(nèi)皮細(xì)胞于SIS 支架上生長狀態(tài)良好（圖4）。

討 論

以自體血管移植手術(shù)這種以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷的辦法加重了患者的痛苦與損傷[4]，且由于自體靜脈與動(dòng)脈在結(jié)構(gòu)上存在差異，長度、內(nèi)徑匹配的自體血管有限，以及靜脈本身病變率較高等缺點(diǎn)，嚴(yán)重限制自體血管的臨床應(yīng)用[1]。

圖3 小腸黏膜下層接種內(nèi)皮細(xì)胞前后的生長狀態(tài)比較。A.內(nèi)皮細(xì)胞種植前無活細(xì)胞；B.內(nèi)皮細(xì)胞種植后可見大量存活細(xì)胞。比例尺，200μmFig. 3 The observation of the growth state of SIS before and after endothelial cells inoculation. A. no viable cells before endothelial cell inoculation; B.a large number of surviving cells after endothelial cell inoculation; scale bar, 200μm

圖4 小腸黏膜下層支架上內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好。比例尺，200μmFig. 4 The good growth state of endothelial cells on SIS stent. Scale bar, 200μm

小腸黏膜下層為一種天然無免疫原性的細(xì)胞外基質(zhì)材料，并且含有多種細(xì)胞生長因子，如血管生長因子（VEGF）、上皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)、顆粒酶B、轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長因子 β、硫酸蛋白多糖、肝細(xì)胞生長因子、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等[5]，已被廣泛應(yīng)用于異基因組織工程支架的構(gòu)建。FGF-2 可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，創(chuàng)造血管再生的條件[6]。Hang 等人研究表明SIS 可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)，其作用與應(yīng)用VEGF 相似，從而間接表明SIS 中含有VEGF[7]。Hendel 等人研究表明SIS 中的顆粒酶B 可釋放血管內(nèi)皮生長因子并誘導(dǎo)血管通透性[8]。通過機(jī)械方法制備的SIS 具有三維立體結(jié)構(gòu)，孔隙率約60%，可促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖，其具有的機(jī)械強(qiáng)度可有力支撐新生組織[9]。SIS 在皮膚[10]、骨膜[11]、神經(jīng)[9]、膀胱[12,13]、聲帶[14]等組織工程構(gòu)建中已顯示出較好的生物相容性，機(jī)械強(qiáng)度高，無免疫原性，抗微生物活性，以及部位特異的組織再生能力等特性，滿足了組織工程血管的基本要求，在血管組織工程支架材料研究中日益受到重視。

我們使用機(jī)械法制備豬空腸的SIS，隨后去除SIS 上的殘留細(xì)胞，使其成為具有三維立體結(jié)構(gòu)的天然細(xì)胞外基質(zhì)。相關(guān)研究表明，SIS 經(jīng)過制備處理后仍含有前述的多種細(xì)胞生長因子[15]。我們也證明SIS 上含有豐富的層粘連蛋白和纖維連接蛋白，纖維連接蛋白含有精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸序列，可以特異性結(jié)合細(xì)胞膜受體，從而促進(jìn)細(xì)胞粘附；層粘連蛋白也具有促進(jìn)細(xì)胞粘附的作用。內(nèi)皮細(xì)胞接種于SIS 上后，細(xì)胞存活數(shù)量較多，分布比較均勻，內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好，這得益于SIS 上含有較多的層粘連蛋白和纖維連接蛋白，從而也說明了SIS 對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞具有較好的生物相容性。

通過研究SIS 體外擬生態(tài)環(huán)境下與內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)以探索構(gòu)建組織工程血管臨床應(yīng)用的可行性，本實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)皮細(xì)胞和SIS 復(fù)合培養(yǎng)后的生長狀態(tài)良好，具有較好的生物相容性，同時(shí)相關(guān)研究也表明SIS 可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)[3]，故SIS 具有構(gòu)建組織工程血管的能力，可行性較高。另外，豬SIS 基質(zhì)制備方便，價(jià)格低廉，來源穩(wěn)定，為理想的組織工程血管材料。