林潔，高建，段永恒，段山，林圣

（深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 深圳518040）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，高發(fā)年齡為30 ～55 歲，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢，其發(fā)病率仍居于女性癌癥發(fā)病前列[1,2]。宮頸癌從宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變或鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)展而來，按組織結(jié)構(gòu)可劃分為鱗癌、腺癌和腺鱗癌3 種類型，通常都伴隨有人乳頭瘤病毒（HPV）的感染[3,4]。永生化的宮頸正常組織細(xì)胞系和宮頸癌細(xì)胞系是開展宮頸癌體外研究的重要材料，且不同的細(xì)胞系具有不同的HPV 亞型感染和差異化的細(xì)胞特性[5]。

通過轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)基因沉默或過表達(dá)是研究細(xì)胞內(nèi)基因功能的重要技術(shù)手段[6,7]。轉(zhuǎn)染是將外源性基因或基因的反義序列導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并在胞內(nèi)有效表達(dá)。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)按效果可分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）；按轉(zhuǎn)染方式的不同又可分為電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法等[8]。其中脂質(zhì)體介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)染法和電穿孔轉(zhuǎn)染法是常用的兩類轉(zhuǎn)染方式。本研究分別采用多種不同的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑比較它們在轉(zhuǎn)染常用宮頸（癌）細(xì)胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A 和Ect1/E6E7 中的效能，對于所有試劑轉(zhuǎn)染效果皆不佳的細(xì)胞系則測試電穿孔轉(zhuǎn)染的適用性，從而確定針對不同的宮頸（癌）細(xì)胞系最佳的轉(zhuǎn)染方式和轉(zhuǎn)染試劑，為相關(guān)研究提供參考方案。

材料與方法

1 研究采用的細(xì)胞系

宮頸細(xì)胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A、Ect1/E6E7 均購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。其中HeLa 細(xì)胞為HPV18 感染，SiHa 和CaSki 細(xì)胞為HPV16 感染，C33A 細(xì)胞無HPV 感染，而Ect1/E6E7 細(xì)胞為無HPV感染的永生化的正常宮頸上皮細(xì)胞。為保證研究的可靠性，我們采用STR 分型技術(shù)分別對實(shí)驗(yàn)用的這五個細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，以避免細(xì)胞間的混淆污染。

2 主要試劑與儀器

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 和Lipofectamine 3000 購自美國Life 公司，F(xiàn)uGENE HD 購自美國Roche 公司，jetPRIME 購自中國達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國HyClone 公司。pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

電轉(zhuǎn)化儀BEX CUY21 EDIT II 購自日本BEX公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Cellometer K2 購自中國達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，倒置熒光顯微拍照系統(tǒng)購自德國Leica 公司，恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，其它細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自美國Corning 公司。

3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)染

在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天，在24 孔板的每個孔的1ml培養(yǎng)基中加入1×106個細(xì)胞。每個條件設(shè)3 個平行重復(fù)。同時制備實(shí)驗(yàn)所需的pcDNA3.1-EGFP 質(zhì)粒（以下簡稱EGFP 質(zhì)粒），按照NucleoSpin Plasmid 試劑盒步驟提取。

3.1 FuGENE HD 轉(zhuǎn)染方案

將FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑、EGFP 質(zhì)粒放置于室溫中，DMEM 復(fù)溫，轉(zhuǎn)染試劑使用前輕彈混勻。質(zhì)粒使用前快速渦旋幾秒，隨后瞬離。將100μl 無血清培養(yǎng)基加入到無菌1.5ml EP 管中，隨后加入0.5μg EGFP 質(zhì)粒，并充分混勻。再加入1.5μl FuGENE HD并猛烈彈EP 管混勻。室溫靜置15min。將凈置完畢的25μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中。輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

3.2 jetPRIME 轉(zhuǎn)染方案

將50μl jetPRIME buffer加入EP管中，再加0.5μg EGFP 質(zhì)粒。渦旋10s，瞬離。再加1μl jetPRIME reagent，渦旋10s，瞬離。室溫放置10min。將靜置完畢的50μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

3.3 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染方案

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、EGFP 質(zhì)粒和DMEM 放置于室溫中，轉(zhuǎn)染試劑使用前輕彈混勻。將50μl Opti-MEM?培養(yǎng)基加入到無菌1.5ml EP 管中，隨后加入0.5μg EGFP 質(zhì)粒，輕輕混勻。將50μl DMEM 加入到無菌1.5ml EP 管中，隨后加入1.25μl Lipofectamine 2000，室溫孵育5min。孵育完畢后，將上述DNA 稀釋液和Lipofectamine 2000 稀釋液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min。將靜置完畢的100μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。4～6h 后給細(xì)胞換液。

3.4 Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染方案

將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、EGFP 質(zhì)粒和DMEM 放置于室溫中，轉(zhuǎn)染試劑使用前輕彈混勻或渦旋幾秒，隨后瞬離。將25μl DMEM 分別加入到兩個無菌1.5ml EP 管中，隨后各加入0.75μl Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑。將50μl DMEM 加入到另一無菌1.5ml EP 管中，隨后加入0.5μg 待轉(zhuǎn)染EGFP 質(zhì)粒，再加入1μl P3000 Reagent。將稀釋好的DNA 加入到稀釋好的Lipofectamine 3000 中各25μl。室溫靜置5min。將靜置完畢的50μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

4 電穿孔轉(zhuǎn)染

電轉(zhuǎn)之前細(xì)胞傳兩個或多個10cm 大皿。細(xì)胞長到90%時，離心收集細(xì)胞，350×g 離心4min，棄掉上清。加6ml 的OPTI-MEM 培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞，離心，棄上清。用1ml OPTI-MEM 重懸細(xì)胞，液體移到EP 管，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。同時重懸的細(xì)胞350×g 離4min，徹底去掉上清。用OPTI-MEM 重懸細(xì)胞（15μl OPTI-MEM/100 萬細(xì)胞）。取足量細(xì)胞液到另一EP 管，加質(zhì)粒（5μg 質(zhì)粒/100 萬細(xì)胞），充分混勻液體。用OPTI-MEM 潤洗電極杯，吸盡OPTI-MEM，緩慢加入18μl 混合液到電極杯，保證液體落到杯底部，并防止氣泡產(chǎn)生，以免影響轉(zhuǎn)化效率。將電極杯放入電極杯座上，測定電阻，通過添加OPTI-MEM調(diào)節(jié)電阻值在140Ω到200Ω之間后開始電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)結(jié)束后取出電極杯，向其中添加150μL 的OPTI-MEM。用吸管充分混勻細(xì)胞，種到培養(yǎng)板中，加1.5ml 培養(yǎng)基，混勻?？瞻讓φ占?8μl細(xì)胞液，每組設(shè)3 個平行。然后在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

5 轉(zhuǎn)染效率的檢測與比較

轉(zhuǎn)染24h 之后在倒置熒光顯微鏡下分別對每個孔的細(xì)胞在明場和熒光場下進(jìn)行指定位置的拍照，以獲取直觀的轉(zhuǎn)染效率圖像。再用胰酶消化五株宮頸（癌）細(xì)胞系，10%小牛血清培養(yǎng)液終止消化，吹打，制成細(xì)胞懸液。500×g 離心5min。棄去上清，用PBS 重懸，500×g 離心5min。棄去上清，用適量PBS 重懸，最后使用Cellometer K2 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀自動化測定攜帶熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有檢測結(jié)果均采用SPSS Statistics 22 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個樣本機(jī)器檢測3 次取均值作為觀測值。每個細(xì)胞的每種處理取3 個復(fù)孔的觀測值計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并用方差分析對多組均數(shù)做顯著性檢驗(yàn)，如差異有顯著性意義，則進(jìn)一步采用LSD法做樣本均數(shù)之間的兩兩比較，確定哪兩個均數(shù)之間有顯著性差異，以評估各種轉(zhuǎn)染方案的優(yōu)劣。

結(jié) 果

1 STR 分型鑒定研究采用的宮頸（癌）細(xì)胞系

本實(shí)驗(yàn)研究對象為廣泛應(yīng)用的5 種宮頸（癌）細(xì)胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A、Ect1/E6E7。它們有不同的形態(tài)特征、生長特性和HPV 感染狀態(tài)，對于全面探索宮頸癌變機(jī)理具有重大的價值[5]。然而有報(bào)道指出，目前世界范圍內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室凍存的細(xì)胞株存在著嚴(yán)重的交叉污染問題，導(dǎo)致研究結(jié)果與實(shí)際有較大偏差[9,10]。鑒于此，我們對于此前購買并凍存和培養(yǎng)的以上5 個細(xì)胞系，采用STR 分型技術(shù)進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果如表1 所示，5 個細(xì)胞系均與ATCC 等原始出處給予的鑒證信息相匹配，表明細(xì)胞系純粹無污染，可準(zhǔn)確應(yīng)用于相應(yīng)的研究。

2 四種常用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染五個宮頸（癌）細(xì)胞系的效果比較

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是實(shí)驗(yàn)研究中最常用也是最便捷的傳遞核酸進(jìn)細(xì)胞的方式[11]。我們檢測了4 種常用的以脂質(zhì)體介導(dǎo)為原理的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑：FuGENE HD、jetPRIME、Lipofectamine 2000（以下簡稱Lipo 2000）和Lipofectamine 3000（以下簡稱Lipo3000），在分別轉(zhuǎn)染上述5 個常見的宮頸（癌）細(xì)胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A 和Ect1/E6E7 時的效率。在各轉(zhuǎn)染試劑用戶指南推薦的操作流程和推薦的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑濃度配比下，實(shí)驗(yàn)達(dá)到的轉(zhuǎn)染效率有顯著差異。在倒置熒光顯微鏡下同一視野的影像（圖1）顯示，明場展示所有存活的貼壁細(xì)胞，熒光場展示轉(zhuǎn)染EGFP 質(zhì)粒成功在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞。為了進(jìn)一步定量地比較轉(zhuǎn)染效率的差異，我們將細(xì)胞消化后在自動化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的輔助下測定熒光細(xì)胞比例（圖2）?？梢钥吹剑贖eLa 細(xì)胞中，jetPRIME 的轉(zhuǎn)染效率最高達(dá)到66.3%，而Lipo 3000也達(dá)到較高的效率為37.4%。HeLa 是宮頸癌研究最為廣泛應(yīng)用的細(xì)胞系，大多數(shù)化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑在開發(fā)時都以此細(xì)胞系作為測試和優(yōu)化，因此都能達(dá)到比較高的轉(zhuǎn)染效率。四種轉(zhuǎn)染試劑在SiHa 細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率相接近，均在10%～15%左右。在C33A細(xì)胞系Lipo3000 和jetPRIME 中分別取得16.0%和11.9%的轉(zhuǎn)染率，而FuGENE HD 和Lipo 2000 的轉(zhuǎn)染率都很低下。對于CaSki 細(xì)胞系和Ect1/E6E7（簡稱為E6E7）細(xì)胞系，4 種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率都很低，不能夠滿足基因功能研究的需求。

表1 各細(xì)胞系STR 分型鑒定結(jié)果Tab. 1 The STR genotyping verification results of each cell line

3 電穿孔法提升化學(xué)轉(zhuǎn)染法難轉(zhuǎn)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率

對于化學(xué)難轉(zhuǎn)的CaSki 細(xì)胞系和Ect1/E6E7 細(xì)胞系，我們嘗試采用電穿孔轉(zhuǎn)染的方式提高其基因轉(zhuǎn)染效率。BEXCUY21 EDIT II 具有一套組合脈沖系統(tǒng)：高壓“穿孔脈沖”和低壓“驅(qū)動脈沖”。極短的高壓穿孔脈沖在細(xì)胞表面形成很多小孔，隨后低壓驅(qū)動脈沖可引導(dǎo)DNA 或藥物進(jìn)入細(xì)胞，通過調(diào)整脈沖時間和脈沖間隔可得到極佳的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞生存率。電穿孔轉(zhuǎn)染最重要的影響條件為其穿孔電壓，因而我們測試了在梯度電壓下其轉(zhuǎn)染效率的變化。在相同的7ms 脈沖波長、10ms 脈沖間隙和20V 驅(qū)動電壓下，不同穿孔電壓得到的CaSki 細(xì)胞系和Ect1/E6E7 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)一定的波動，在170V 處轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，且均高于化學(xué)轉(zhuǎn)染法（圖3）。

討 論

通過比較選擇和優(yōu)化轉(zhuǎn)染方案是開展眾多細(xì)胞學(xué)和動物學(xué)研究的前提條件[12,13]。本實(shí)驗(yàn)按照四種轉(zhuǎn)染試劑說明書推薦的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑用量，針對5株宮頸癌細(xì)胞，比較4 種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染GFP 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞的生長狀態(tài)也是影響轉(zhuǎn)染效率的一個重要因素，本研究選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，保證細(xì)胞在最佳狀態(tài)下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。研究表明同一種轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行不同細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染，得到的轉(zhuǎn)染效率不同[14]。例如jetPRIME 轉(zhuǎn)染試劑在Hela 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到66%，而在CaSki 細(xì)胞中低到0.3%。這可能與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。同樣的，實(shí)驗(yàn)表明，4 種轉(zhuǎn)染試劑在同一株細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率不同。例如，在Hela 細(xì)胞中jetPRIME 轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到66%，而Lipofectamine 2000 只有7.4%。也有其他研究者證明不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染同一株細(xì)胞得到的轉(zhuǎn)染效率不同，這可能與轉(zhuǎn)染復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的方式有關(guān)[15-18]。再者，多個實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有一定的毒性[15,16,19-22]，在本實(shí)驗(yàn)中不僅轉(zhuǎn)染效果差，在轉(zhuǎn)染4h 之后還要換液，操作麻煩且易造成換液過程中細(xì)胞的損失，因此不推薦使用[23]。

圖1 倒置熒光顯微鏡下4 種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率比較。比例尺，100μmFig. 1 Comparison for transfection efficiency of 4 transfection reagents under the inverted fluorescence microscope. Scale bar, 100μm

FuGENE HD、jetPRIME、Lipofectamine 2000 和Lipofectamine 3000 這4 種轉(zhuǎn)染試劑對Ect1/E6E7、CaSki 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果都很差，轉(zhuǎn)染效率均低于10%。因此我們考慮用電穿孔轉(zhuǎn)染法探索最佳轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)首先對電轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的摸索和優(yōu)化，最后在相同的脈沖波長7ms、脈沖間隙10ms 和驅(qū)動電壓20V 的條件下，設(shè)計(jì)穿孔電壓梯度，探索最佳穿孔電壓。Cellometer K2 定量檢測結(jié)果表明，針對難轉(zhuǎn)細(xì)胞系Ect1/E6E7、CaSki，在穿孔電壓為170V 時，電穿孔轉(zhuǎn)染法可以得到高出化學(xué)轉(zhuǎn)染法三、四倍的轉(zhuǎn)染效率，改善了難轉(zhuǎn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很低的情況。但電轉(zhuǎn)染給細(xì)胞造成很大的損傷，細(xì)胞存活率不高，細(xì)胞恢復(fù)正常的生長狀態(tài)慢[20,24-27]。因此，電穿孔轉(zhuǎn)染法更適用于難轉(zhuǎn)細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[28]。

圖2 4 種轉(zhuǎn)染試劑在各細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染效率比較。*，與轉(zhuǎn)染效率最高的試劑比較, P＜0.001Fig. 2 Comparison for transfection efficiency of 4 transfection reagents in each cell line. *, P＜0.001 compared with the highest transfection efficiency group

圖3 CaSki 和Ect1/E6E7 細(xì)胞系在不同穿孔電壓下電轉(zhuǎn)效率比較。與轉(zhuǎn)染效率最高的電壓比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001Fig. 3 Comparison for electransfection efficiency in CaSki and Ect1/E6E7 cells under series of poration pulse voltage. Compared with the voltage with the highest transfection efficiency∶ *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01; ***, P＜0.001

在后續(xù)針對宮頸細(xì)胞系開展的研究中，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果有目的性地選擇合適的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑或電穿孔轉(zhuǎn)染方案，將能顯著地提升實(shí)驗(yàn)效果，簡化條件摸索的過程。