張文剛 張 杰 黨 斌 楊希娟

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)為藜科藜屬一年生雙子葉植物，原產(chǎn)于南美安第斯地區(qū)，由于其性質(zhì)特征與小麥、水稻等常見谷物類似而被稱為“假谷物”，它是目前聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)認(rèn)為唯一能滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的“全營(yíng)養(yǎng)食品”[1]。藜麥蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等顯著高于一般谷物，同時(shí)富含多酚、黃酮、皂苷、多糖等活性成分，表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓、降血糖等功效，被國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱為“營(yíng)養(yǎng)黃金”“未來食品”等[2-3]。目前，藜麥在中國(guó)山西、陜西、青海、四川、浙江等地區(qū)均有種植，作為一種“健康食品”原料具有廣闊的開發(fā)前景[4]。

黃酒在中國(guó)釀造歷史悠久，制作原料主要以稻米、黍米、小米、玉米等為主，其含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素，還含有多種有機(jī)酸、酯類物質(zhì)及礦物質(zhì)，兼具良好的食用和藥用價(jià)值[5-7]，對(duì)避免當(dāng)下精加工食品功能營(yíng)養(yǎng)缺乏、防治慢性代謝疾病、改善腸道菌群、降低膽固醇等有積極意義[8]。傳統(tǒng)黃酒釀造工藝周期長(zhǎng)、原料利用率低、勞動(dòng)投入大，近年來廣泛使用的液化法釀造新工藝以微生物和酶制劑的液化、糖化和發(fā)酵為基礎(chǔ)，具有適用性廣、效率高、醪液流動(dòng)性可控、易機(jī)械化等優(yōu)點(diǎn)，在多種雜糧黃酒的釀制中已有應(yīng)用[9-10]。劉浩等[11]以炒制燕麥為原料，利用液化法制作燕麥黃酒，優(yōu)化工藝后可得到口味醇爽、品質(zhì)符合國(guó)標(biāo)的黃酒產(chǎn)品；楊祖滔等[12]研究顯示，在最佳條件下薏米糯米黃酒香味清幽、口感醇和、色澤鮮亮。黃酒發(fā)酵過程中原料多酚和黃酮溶出，單寧轉(zhuǎn)化為小分子酚類，蛋白質(zhì)部分分解為活性多肽和氨基酸，這些物質(zhì)是其發(fā)揮清除自由基、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、抗菌消炎等多種生理功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[13-14]。藜麥具有“全營(yíng)養(yǎng)”特征，具有發(fā)展不同類型功能黃酒的良好前景。目前，藜麥黃酒研究尚處初始階段，對(duì)其加工技術(shù)及功能性分析還需深入探討。

試驗(yàn)擬以藜麥為原料，采用液化法發(fā)酵藜麥黃酒，對(duì)液化、糖化及主發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上探討發(fā)酵過程中酒體抗氧化特性，以期為藜麥黃酒等發(fā)酵產(chǎn)品的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青藜2號(hào)：青海省農(nóng)林科學(xué)院作物所；

耐高溫α-淀粉酶(4.0×104U/g)、糖化酶(1.0×105U/g)：食品級(jí)，江蘇瑞陽(yáng)生物科技有限公司；

活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；

葡萄糖、福林酚、酪蛋白磷酸肽(Gly-Gly-Tyr-Arg)：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

3,5-二硝基水楊酸(DNS)、苯酚、過硫酸鉀、硫片：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、碳酸鈉、三氯乙酸(TCA)、硫酸銅：分析純，天津市津北精細(xì)化工有限公司；

試驗(yàn)中使用的水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：N4S型，上海儀電分析儀器公司；

電子天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH-150型，上海齊欣科學(xué)儀器公司；

高速中藥粉碎機(jī)：FW200型，天津華鑫儀器廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101A-2ET型，上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DKB-600B型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

離心機(jī)：Centrigue 5430R型，德國(guó)艾本德公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥預(yù)處理 藜麥除雜清洗后45 ℃烘干，磨粉過60目篩，取藜麥粉適量按一定料液比95 ℃糊化10 min。

1.3.2 還原糖含量測(cè)定 采用DNS法[12]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)梯度為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，2.0 mL，實(shí)際樣品3 000 r/min離心后取上清液測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.3.3 酒精含量測(cè)定 采用比重法[15]。

1.3.4 藜麥液化、糖化條件優(yōu)化 以還原糖含量為指標(biāo)，通過單因素和L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)化藜麥液化、糖化條件。液化探討因素包括液化時(shí)間(10，20，30，40，50，60 min)、耐高溫α-淀粉酶添加量(3，4，5，6，8，10 U/g)、液化溫度(80，85，90，95，100 ℃)；糖化探討因素包括糖化時(shí)間(30，60，90，120，150，180，210，240 min)、加酶量(50，60，70，80，90，100，110 U/g)、糖化溫度(40，45，50，55，60，65，70，75 ℃)。液化單因素試驗(yàn)固定條件：液化時(shí)間40 min、耐高溫α-淀粉酶添加量5 U/g、液化溫度95 ℃、料水比1.0∶3.5(g/mL)；糖化單因素試驗(yàn)固定條件：糖化時(shí)間90 min、糖化酶添加量80 U/g、糖化溫度60 ℃。

1.3.5 藜麥黃酒主發(fā)酵條件優(yōu)化 以酒精含量為指標(biāo)，通過單因素和L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)化藜麥黃酒主發(fā)酵條件。探討因素包括料水比[1.0∶2.5，1.0∶3.0，1.0∶3.5，1.0∶4.0，1.0∶4.5，1.0∶5.0(g/mL)]、酵母接種量(3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%)、發(fā)酵溫度(24，26，28，30，32，34，36 ℃)。在優(yōu)化參數(shù)下發(fā)酵藜麥黃酒，持續(xù)發(fā)酵8 d，連續(xù)監(jiān)測(cè)總酚、總黃酮、多肽含量及抗氧化性。主發(fā)酵單因素試驗(yàn)固定條件：料水比1.0∶3.5(g/mL)、酵母接種量4.0%、發(fā)酵溫度28 ℃。

1.3.6 總酚、總黃酮含量測(cè)定 參照Adom等[16]的方法，結(jié)果分別以沒食子酸當(dāng)量(μmol/100 g·DW)和Trolox當(dāng)量(μmol/100 g·DW)表示。

1.3.7 多肽含量測(cè)定 參照康樹杰等[17]的方法。酪蛋白磷酸肽濃度梯度為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mg/mL(5% TCA)，樣品以等體積10% TCA沉蛋白后，4 000 r/min離心15 min，取上清定容后，540 nm處測(cè)定OD值，按式(1)計(jì)算多肽的質(zhì)量濃度。

C1=C0×50/2.5×100%，

(1)

式中：

C1——樣品多肽的質(zhì)量濃度，g/L；

C0——標(biāo)準(zhǔn)曲線中的多肽濃度，g/L。

1.3.8 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

(1)DPPH自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[18]。

(2)ABTS+自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[19]。

(3)FRAP鐵還原力：參照文獻(xiàn)[20]。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用Minitab 15軟件及Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥液化工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇適宜參數(shù)水平(見表1)，以還原糖含量為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2、3可知，各因素對(duì)藜麥液化程度的影響主次順序?yàn)楦邷卅?淀粉酶添加量>液化溫度>液化時(shí)間，最佳條件組合為A3B3C2，即液化時(shí)間50 min、酶添加量6 U/g、液化溫度95 ℃；酶添加量和液化溫度對(duì)液化物還原糖含量均有顯著影響(P<0.05)，液化時(shí)間影響不顯著；與劉浩等[11]研究結(jié)果基本一致。

表1 藜麥液化正交試驗(yàn)因素水平表

表2 藜麥液化正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 藜麥液化正交試驗(yàn)方差分析表?

2.2 藜麥糖化工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇適宜參數(shù)水平(見表4)，以還原糖含量為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 藜麥糖化正交試驗(yàn)因素水平表

表5 藜麥糖化正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 藜麥糖化正交試驗(yàn)方差分析表?

由表5、6可知，各因素對(duì)藜麥糖化程度的影響主次順序?yàn)樘腔瘻囟?糖化酶添加量>糖化時(shí)間，最佳條件組合為A3B3C2，即糖化溫度70 ℃、糖化酶添加量100 U/g、糖化時(shí)間150 min，與劉浩等[11]研究結(jié)果一致；3個(gè)糖化影響因素對(duì)還原糖含量的影響均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.3 藜麥主發(fā)酵工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇適宜參數(shù)水平(見表7)，以酒精度為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表8，方差分析見表9。

由表8、9可知，各因素對(duì)醪液主發(fā)酵影響最大的為料水比，其次為酵母接種量，發(fā)酵溫度影響相對(duì)較??；最優(yōu)條件為A2B2C2，即料水比1∶4(g/mL)、酵母接種量4.0%、發(fā)酵溫度30 ℃；料水比和酵母接種量對(duì)酒精度影響顯著(P<0.05)。

2.4 發(fā)酵過程中黃酒活性成分及抗氧化活性的變化

2.4.1 總酚、總黃酮含量 由圖1可知，總酚、總黃酮含量在整個(gè)發(fā)酵過程中均先增大后減小，在發(fā)酵6 d后又出現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì)。發(fā)酵前5 d，隨著酵母繁殖和代謝作用的增強(qiáng)，發(fā)酵液酒精含量逐漸提高，使得總酚、總黃酮不斷被浸提出[21]，同時(shí)在酵母作用下物料部分結(jié)合酚類被溶出，使得酚類化合物總量逐漸升高；發(fā)酵5～6 d時(shí)，酚類化合物明顯降低，可能與單體酚聚合及酚類物質(zhì)氧化等作用有關(guān)[22]；發(fā)酵6 d后，發(fā)酵體系中糖分減少使得發(fā)酵放緩，但隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)料液酒精度增加緩慢，部分結(jié)合酚釋放及酚類繼續(xù)溶出，使得酚類化合物含量再次增加。

表7 藜麥主發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平表

表8 藜麥主發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

表9 藜麥主發(fā)酵正交試驗(yàn)方差分析表?

圖1 藜麥糖化物發(fā)酵過程中總酚、總黃酮的變化

Figure 1 Changes in total polyphenol and total flavonoid contents during the fermentation of quinoa saccharide

2.4.2 多肽含量 由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中多肽含量先升高后降低，發(fā)酵第4天，多肽含量達(dá)到最大值4.95 g/L；發(fā)酵7 d后多肽含量趨于穩(wěn)定，保持在3.20 g/L左右。藜麥發(fā)酵過程中多肽主要來源于兩個(gè)方面：① 微生物自溶；② 原料中的蛋白質(zhì)分解。在發(fā)酵初期酵母大量繁殖并不斷自溶，細(xì)胞中多肽釋放進(jìn)入發(fā)酵液中，同時(shí)蛋白質(zhì)較多降解形成多肽；而在發(fā)酵后期微生物生長(zhǎng)繁殖能力下降且蛋白質(zhì)含量減少，多肽的形成與分解相對(duì)平衡，發(fā)酵液中多肽含量變化趨于穩(wěn)定。

圖2 藜麥糖化物發(fā)酵過程中多肽含量的變化

2.4.3 抗氧化性 由圖3可知，DPPH自由基清除力、ABTS+自由基清除力及鐵還原力在發(fā)酵過程中總體呈先增大后減小趨勢(shì)。DPPH自由基清除能力在發(fā)酵第3天達(dá)最大值，之后快速降低，第4～8天變化緩慢；ABTS+自由基清除能力在發(fā)酵第4天達(dá)最高，第4～6天快速降低，而第6～8天出現(xiàn)波動(dòng)；FRAP還原力在發(fā)酵初始(1～3 d)保持在較高水平，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，還原力逐漸下降，第8天保持在12.86 μmol/100 g·DW。藜麥發(fā)酵液中抗氧化性的變化可能與其活性物質(zhì)含量和組成相關(guān)，總酚可能對(duì)FRAP鐵還原力和DPPH自由基清除力影響較大，而總黃酮、多肽可能對(duì)ABTS+自由基清除能力影響較大。

圖3 藜麥糖化物發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

3 結(jié)論

(1)藜麥黃酒的最佳液化、糖化及主發(fā)酵工藝條件為：耐高溫α-淀粉酶添加量6 U/g，液化溫度95 ℃，液化時(shí)間50 min；糖化酶添加量100 U/g、糖化溫度70 ℃、糖化時(shí)間150 min；料水比1∶4(g/mL)、酵母添加量4.0%、發(fā)酵溫度30 ℃。

(2)藜麥黃酒含有較多活性物質(zhì)且隨發(fā)酵時(shí)間呈動(dòng)態(tài)變化，其中黃酒總酚、總黃酮在主發(fā)酵第5天達(dá)到峰值，后發(fā)酵階段仍能保持較高水平；多肽含量發(fā)酵第4天達(dá)到4.95 g/L，發(fā)酵后期保持在3.20 g/L，發(fā)酵過程是酒體特征及活性物質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí)期。

(3)藜麥黃酒清除DPPH、ABTS+自由基能力及FRAP鐵還原力呈先升高后降低趨勢(shì)，發(fā)酵第3天總體抗氧化性最強(qiáng)，發(fā)酵后期仍保持一定抗氧化活性；發(fā)酵液的體外抗氧化特征可能與其活性物質(zhì)的形成及變化有關(guān)。

(4)試驗(yàn)中酵母添加量大，但發(fā)酵較緩慢，發(fā)酵物酒精度偏低，主要由于藜麥經(jīng)液化糖化后還原糖含量低；后續(xù)可從醪液糖度調(diào)控、酵母選擇等方面優(yōu)化，并結(jié)合抗氧化性特征，制作品質(zhì)、功能性較優(yōu)的藜麥黃酒產(chǎn)品。