不同鹽脅迫條件下東方杉的生長(zhǎng)及生理響應(yīng)研究

孔 強(qiáng) 馬曉華 宮莉霞 張旭樂(lè) 項(xiàng)德強(qiáng) 鄭 堅(jiān)

( 1. 樂(lè)清市林業(yè)局，浙江 溫州 325600；2. 浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005)

東方杉(Taxodium mucronatum×Cryptomeria fortunei)為杉科落羽杉屬，半常綠的高大喬木，是1963年我國(guó)著名林木育種家葉培忠教授將中國(guó)柳杉和墨西哥落羽杉進(jìn)行跨屬雜交育成的杉科新樹(shù)種[1]。東方杉樹(shù)形優(yōu)美，適應(yīng)性十分廣泛，其具有生長(zhǎng)迅速、耐鹽堿和耐水濕能力強(qiáng)等特點(diǎn)，且具有較強(qiáng)的抗風(fēng)能力[2]，因此東方杉近年在沿海防護(hù)林和生態(tài)公益林的建設(shè)中逐步受到青睞。

有研究表明，沿海地帶土壤主要表現(xiàn)為鹽堿含量高、表層板結(jié)、海水倒灌反鹽，十分不利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。目前，我國(guó)擁有大面積的鹽堿地，僅海岸帶、灘涂地等就達(dá)670多萬(wàn)hm2，且有逐年遞增的趨勢(shì)[4]。在我國(guó)人口不斷增加，耕地面積日趨緊張和淡水資源不斷減少的嚴(yán)峻形勢(shì)下，鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用已是國(guó)內(nèi)外生物學(xué)者迫切需要解決的研究課題。在鹽堿地土壤對(duì)植物的危害中通常認(rèn)為在無(wú)機(jī)鹽對(duì)植物生長(zhǎng)的危害是最顯著的，大部分植物或農(nóng)作物都對(duì)NaCl極為敏感，即使是在低鹽度條件下的 50 mmol/L NaCl對(duì)于具有一定耐鹽能力的水稻（Oryza sativa）也具有致死作用[5]。本研究對(duì)2年生東方杉鹽脅迫試驗(yàn)，測(cè)定和分析其在鹽脅迫環(huán)境下的各項(xiàng)形態(tài)及生理指標(biāo)，以期探討鹽脅迫條件下東方杉的生長(zhǎng)及生理變化，為開(kāi)發(fā)及選育耐鹽性強(qiáng)的植物資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015 年4 月，于浙江溫州（119°37′～121°18′E；27°06′～28°36′N）智能溫室進(jìn)行東方杉耐鹽性試驗(yàn)，選用健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致（苗高為（62±0.5）cm，地徑為（68±0.5）mm）的2年生東方杉，在光強(qiáng)為1000 μmol /(m2·s)， 溫度為 28 ℃/25 ℃(晝/夜)，光周期為12 h，濕度為（70 ± 5）%的條件下進(jìn)行水培試驗(yàn)研究。營(yíng)養(yǎng)液配比按照霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液作一定調(diào)整后配制。營(yíng)養(yǎng)液配方如下：Ca(NO3)2·4H2O 2.00 mmol/L，KH2PO40.10 mmol /L，MgSO4·7H2O 0.50 mmol /L，KCl 0.10 mmol/L，K2SO40.70 mmol/L，H3BO310.00 μmol/L，MnSO4·H2O 0.50 μmol/L，ZnSO4·7H2O 1.00 μmol/L，CuSO4·5H2O 0.20 μmol/L，(NH4)6Mo7O240.01 μmol/L，F(xiàn)e-EDTA 100 μmol /L。

1.2 試驗(yàn)方法

東方杉植株適應(yīng)生長(zhǎng)2個(gè)月后，開(kāi)始進(jìn)行不同濃度的鹽處理。選用容積為10 L的塑料桶，每桶1株，培養(yǎng)液體積為7.5 L。試驗(yàn)設(shè)置0‰（CK）、3‰（T1）、6‰（T2）3個(gè)鹽脅迫濃度，每個(gè)濃度重復(fù)5次。在處理前后的培養(yǎng)過(guò)程中每天用pH計(jì)測(cè)定營(yíng)養(yǎng)液pH值，隔天用 1 mol/L H3PO4或 1 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH，保持營(yíng)養(yǎng)液pH為5.8；保持24 h連續(xù)通氣，每8 d換1次營(yíng)養(yǎng)液。分別于處理后的第 10、20、30、40 和 50天上午 7：00—8：00采取每株葉位相近的當(dāng)年生葉片，用封口袋裝并做好標(biāo)記后置于冰盒中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用液氮冷凍后于-80℃冰箱保存，用于測(cè)定其各項(xiàng)生理和生化指標(biāo)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

分別在試驗(yàn)處理第10、20、30、40、50天時(shí)用鋼直尺（精度0.1 mm）測(cè)量各處理東方杉的固定枝長(zhǎng)長(zhǎng)度，按公式（1）計(jì)算東方杉固定枝條相對(duì)生長(zhǎng)長(zhǎng)度，即生長(zhǎng)增量。

相對(duì)生長(zhǎng)長(zhǎng)度=試驗(yàn)測(cè)量時(shí)長(zhǎng)度-試驗(yàn)處理前長(zhǎng)度（1）

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

分別于試驗(yàn)處理第10、20、30、40、50天采集0.2 g脅迫后的東方杉葉片，采用茚三酮比色法[6]用UV-2550分光光度計(jì)（島津公司，日本）測(cè)定葉片內(nèi)的脯氨酸含量；根據(jù)Armon[7]的方法，于663 nm和645 nm測(cè)定葉綠素含量；采用NBT比色法[8]測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性；參照Buege等[9]的方法用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量；采用電導(dǎo)法[10]測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率（REC）。

1.4 分析方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽迫條件下植物存苗率及葉色變化

鹽脅迫對(duì)東方杉存苗率和葉形態(tài)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽脅迫對(duì)東方杉存苗率和葉形態(tài)的影響Table 1 Effects of salt cooperative force on the rate and form of T. mucronatum×C. fortunei seedlings

由表1可知，鹽脅迫50 d后，不同鹽脅迫存苗率的處理間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），T1的存苗率與CK無(wú)顯著差異，T2的存苗率顯著地低于CK與T1（P＜0.05）。東方杉在T1脅迫下處理50 d后的葉色葉形表現(xiàn)生長(zhǎng)，與CK無(wú)顯著差異；在T2脅迫下處理50 d后，葉色出現(xiàn)變黃的現(xiàn)象。

2.2 鹽脅迫條件下植東方杉固定枝條相對(duì)生長(zhǎng)長(zhǎng)度變化

由圖1可知，不同鹽濃度處理?xiàng)l件下的東方杉生長(zhǎng)速度不同，在鹽脅迫處理的前期，T1枝條的生長(zhǎng)未受到顯著抑制，而在脅迫理至50 d時(shí)，相比CK，T1枝條的生長(zhǎng)出現(xiàn)緩慢減弱的現(xiàn)象。而T2枝條從第20天開(kāi)始呈現(xiàn)出顯著地生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象（P＜0.05）；脅迫至第50天時(shí)，T2脅迫下東方杉枝條生長(zhǎng)是CK的18.1%。

圖1 不同鹽脅迫下東方杉的相對(duì)生長(zhǎng)長(zhǎng)度變化Fig. 1 Changes of relative growth length of T. mucronatum×C. fortunei under different salt stress conditions

2.3 鹽脅迫條件下東方杉葉片中葉綠素含量變化

由圖2可知，在試驗(yàn)脅迫的前40 d，T1新葉中的葉綠素含量與CK相比未出現(xiàn)顯著差異；在脅迫第50天時(shí)，T1葉片葉綠素含量顯著低于CK（P＜0.05），是CK的88.9%。而在T2脅迫下，20 d后其葉綠素含量顯著低于CK和T1（P＜0.05），隨著處理時(shí)間的增加；在脅迫至第50天時(shí)，T2新葉葉綠素含量是CK的37.6%。

圖2 不同鹽脅迫下東方杉葉綠素含量變化Fig. 2 Changes of chlorophyll content of T. mucronatum×C. fortunei under different salt stress conditions

2.4 鹽脅迫條件下東方杉葉片MDA含量與REC的變化

由圖3可知，T2脅迫下MDA含量隨著處理時(shí)間的增加而增加，且顯著高于CK和T1（P＜0.05），在脅迫至第50天時(shí)，分別是CK和T1的3.49和2.60倍。試驗(yàn)40 d前，T1的MDA含量與CK無(wú)顯著差異；在第50天時(shí)，T1的MDA含量顯著高于 CK（P＜0.05），是 CK的 1.34倍。在 T2下，東方杉REC值顯著高于CK與T1（P＜0.05），在試驗(yàn)至第50天時(shí)，分別是CK和T1的1.97和1.51倍。試驗(yàn)40 d前，T1的REC與CK差異不顯著；在第50天時(shí)，T1的REC顯著高于CK（P＜0.05），是CK的1.30倍。

圖3 不同鹽脅迫下東方杉MDA含量與REC變化Fig. 3 Changes of MDA content and REC of T. mucronatum×C. fortunei under different salt stress conditions

2.5 鹽脅迫條件下東方杉葉片中脯氨酸含量的變化

如圖4可知，T1和T2的脯氨酸含量在第20天時(shí)顯著高于CK（P＜0.05）；在脅迫30 d后，T1脅迫的脯氨酸含量有所下降，但仍顯著高于CK（P＜0.05），而T2的脯氨酸含量繼續(xù)增加，顯著高于CK與T1的脯氨酸含量（P＜0.05），是CK的2.12倍；在脅迫50 d后，T1的脯氨酸含量仍顯著高于CK（P＜0.05），T2的脯氨酸含量為CK的2.70倍。

2.6 鹽脅迫條件下東方杉葉片SOD活性的變化

由圖5可知，隨著處理時(shí)間的增加，T1和T2的SOD活性均顯著高于CK（P＜0.05）。在脅迫至第40天時(shí)，T2的SOD活性達(dá)到最高值，分別是CK與T1的1.34與1.25倍；在脅迫至第50天時(shí)，T2的SOD活性下降。

圖4 不同鹽脅迫下東方杉脯氨酸含量變化Fig. 4 Changes of proline content of T. mucronatum×C. fortunei under different salt stress conditions

圖5 不同鹽脅迫條件下東方杉SOD活性變化Fig. 5 Changes of SOD activity of T. mucronatum×C. fortunei under different salt stress conditions

3 結(jié)論與討論

鹽脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因素之一。高鹽度對(duì)植物的毒害可以導(dǎo)致植物生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量降低甚至植株死亡[11]。在鹽脅迫條件下，植物體內(nèi)的主要生理生化過(guò)程， 如水分吸收、光合作用、能量和物質(zhì)代謝等均會(huì)受到不同程度的抑制?？傮w來(lái)說(shuō)，鹽脅迫主要通過(guò)細(xì)胞膜滲透脅迫、離子毒害及營(yíng)養(yǎng)失衡等對(duì)植物進(jìn)行生長(zhǎng)抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，在T2鹽脅迫條件下，東方杉的枝條生長(zhǎng)量減少，生長(zhǎng)受到顯著抑制，而在較低的鹽濃度（T1）條件下，東方杉的枝條增量與對(duì)照組差異不顯著。這表明東方杉枝條在高濃度的鹽脅迫條件下，植物體為維持滲透壓的穩(wěn)定，加劇了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和積累，這就導(dǎo)致了植物體內(nèi)的能量消耗增加，進(jìn)一步限制了植物的生長(zhǎng)[12]。

葉綠素是與植物光合作用相關(guān)的最重要的色素，鹽脅迫可能破壞植物葉片內(nèi)的葉綠體功能結(jié)構(gòu)，從而使葉綠素合成減少，含量降低下降，最終導(dǎo)致植株光合力減弱[13]。低濃度的鹽脅迫可以刺激植物體內(nèi)的保護(hù)機(jī)制，促使葉綠素含量增加[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鹽脅迫處理初期，東方杉葉片內(nèi)的葉綠素含量與CK差異不顯著，而隨著處理時(shí)間的增加，T1鹽脅迫條件下的東方杉葉片葉綠素含量略微下降；而T2鹽脅迫條件下的東方杉葉綠素含量一直顯著低于CK，表明鹽脅迫處理?yè)p害了東方杉的葉綠素合成路徑或合成器官，致使其葉片內(nèi)的葉綠素合成受阻，葉綠素含量降低[15]。

細(xì)胞膜是鹽脅迫對(duì)植物造成傷害的原初位點(diǎn)，尤其是質(zhì)膜，質(zhì)膜在受到鹽脅迫傷害后會(huì)發(fā)生一系列的脅變，它的透性、滲透調(diào)節(jié)等功能都會(huì)因受到傷害而發(fā)生變化[16]。MDA是植物體內(nèi)膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，也是膜系統(tǒng)受傷害程度的重要標(biāo)志之一，REC是反映細(xì)胞膜滲透率的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度的鹽脅迫條件下，東方杉體內(nèi)的MDA含量和REC與CK差異不顯著，這表明東方杉作為耐鹽性較強(qiáng)的植物之一，在較低的鹽脅迫條件下，其細(xì)胞膜并未受到明顯傷害，但鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜亦出現(xiàn)了輕微損傷。而T2對(duì)東方杉植株產(chǎn)生了顯著傷害，其MDA含量和REC相比CK顯著增加。這與錢(qián)瓊秋等[17]的研究相似，表明不同濃度的鹽脅迫和不同的處理時(shí)間可對(duì)植物細(xì)胞膜造成不同程度的傷害。

許多研究表明，植物在鹽脅迫下其滲透保護(hù)物質(zhì)含量會(huì)增加，如茉莉酸、脯氨酸等[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，東方杉在鹽處理下葉片中脯氨酸含量顯著高于CK，表明在東方杉體內(nèi)脯氨酸可作為滲透調(diào)節(jié)物及膜和酶的保護(hù)物質(zhì)對(duì)其起保護(hù)作用。在逆境脅迫條件下，SOD作為植物抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)重要的組成成分之一。它的變化可以反映細(xì)胞清除活性氧的能力，它可以能直接清除H2O2和O2.-，減少活性氧積累對(duì)植物造成的傷害[19]，本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理?xiàng)l件下的東方杉其SOD活性顯著高于CK。這表明鹽脅迫導(dǎo)致了東方杉體內(nèi)活性氧含量的增加，而東方杉啟用自身保護(hù)機(jī)制通過(guò)增強(qiáng)SOD活性來(lái)清除活性氧，維持體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡。本研究對(duì)東方杉在鹽脅迫下枝條增量、生理生化等分析比較，發(fā)現(xiàn)東方杉在3‰的鹽度生境下均能較好生長(zhǎng)，只隨著處理時(shí)間的增加而出現(xiàn)生長(zhǎng)略微受到抑制的現(xiàn)象，而在6‰的鹽度下其生長(zhǎng)明顯受到抑制，直到植株死亡。