丁婉雪，葛瑞瑞，黃金玲，周 鵬，王 靚，甘賢兵，施 慧，范曉蕓

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，安徽 合肥 230012)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心室重構(gòu)與血流動力學(xué)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)，其中氧化應(yīng)激在AMI后心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1]。氧化應(yīng)激損傷主要是心肌細(xì)胞缺血低氧條件下氧自由基大量生成，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，抗氧化酶不斷消耗，抗氧化能力減弱，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心室重構(gòu)的發(fā)生[2-3]。苓桂術(shù)甘湯出自張仲景《傷寒論》，是溫陽益氣、健脾化飲的經(jīng)典名方。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該方能調(diào)節(jié)心力衰竭大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞因子的分泌，改善血流動力學(xué)指標(biāo)，阻抑心室重構(gòu)，改善心功能[4-5]。本研究在前期基礎(chǔ)上深入探討苓桂術(shù)甘湯對H2O2導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠40只、體質(zhì)量為(200±20)g，SD乳鼠20只(1日齡)，均購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2017-001]。

1.2 藥物 ①苓桂術(shù)甘湯：茯苓(批號 20170403)、桂枝(批號 20170312)、白術(shù)(批號 20170213)和甘草(批號 20170410)購自安徽普仁中藥飲片有限公司。苓桂術(shù)甘湯按原方比例(茯苓、桂枝、甘草、白術(shù)質(zhì)量比為4∶3∶3∶2)并參考文獻(xiàn)[6]方法，由安徽省亳州市興和藥業(yè)有限公司制備成干燥粉末(每克干燥粉末含生藥4.8 g)，分裝密封，避光保存?zhèn)溆?。②含藥血清制備：將SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組和給藥組。給藥組用苓桂術(shù)甘湯8.4 g/kg(按照體表面積法計(jì)算相當(dāng)于成人日常用量4倍)灌胃給藥，每日2次，連續(xù)灌胃7 d，末次給藥后45 min，經(jīng)腹主動脈取血，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，0.22 μm濾膜過濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 H2O2(批號 20170901)：德州安捷高科有限公司；膠原酶Ⅱ(批號 EC0111)：美國Sigma公司；Hoechst 33258(批號 20160527)、甲基四唑藍(lán)(MTT)(批號 1117X057)：北京索萊寶生物公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號 P0012)、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)試劑盒(批號 S0101)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(批號 S0131)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(批號 C0016)和氧自由基試劑盒(批號 S0033)：碧云天生物試劑公司；兔抗大鼠抗體α-actin(批號 11163647S)：北京博奧森生物；山羊抗兔IgG二抗Cy3熒光標(biāo)記(批號 ATQJA1701)：美國Abbkine公司；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號 20171208)：上海貝博生物有限公司。

1.4 儀器設(shè)備 3111型恒溫CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo；Ⅸ81熒光倒置顯微鏡：日本Olympus；Accuri C6流式細(xì)胞儀：美國 Becton Dickinson；ATOM酶聯(lián)免疫工作站：意大利MAROCHE。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[7]采用差速貼壁法。取1日齡SD乳鼠，無菌取心臟，用PBS漂洗3次，加入胰蛋白酶，4 ℃過夜；加入等量完全培養(yǎng)基；再加入膠原酶Ⅱ消化液消化15 min；加入與消化液等量的完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入含BrdU(終濃度為1 mmol/L)的完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱，90 min后收集未貼壁的心肌細(xì)胞，24 h后更換為含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)至72 h。

2.2 原代心肌細(xì)胞鑒定 取培養(yǎng)至72 h的原代心肌細(xì)胞，以3×105/mL的細(xì)胞密度種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后。加入4%多聚甲醛固定30 min；Trinton室溫孵育20 min，室溫封閉1 h；棄上清液，加入一抗α-actin(1∶200)，4 ℃過夜孵育；加入Cy3二抗(1∶200)，避光孵育1 h；Hoechst染核10 min；倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 分組及模型復(fù)制 取分離培養(yǎng)72 h的心肌細(xì)胞，分為6組：正常對照組，空白血清(20%)組、H2O2模型組、苓桂術(shù)甘湯含藥血清(5%、10%、20%)組培養(yǎng)12 h后，用H2O2100 μmol/L作用于心肌細(xì)胞6 h。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.4.1 細(xì)胞活性檢測 取分離培養(yǎng)72 h的心肌細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)密度至105/mL，接種于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔，正常對照組及H2O2模型組加入完全培養(yǎng)液，空白血清組加入含20%正常大鼠血清的完全培養(yǎng)液，其余各組分別加入含有5%、10%和20%苓桂術(shù)甘湯含藥血清的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。除正常對照組加入完全培養(yǎng)液外，其余各組均加入含H2O2(100 μmol/L)的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，每孔加入MTT(0.5 mg/mL)20 μL，置于培養(yǎng)箱4 h。加DMSO 150 μL，緩搖10 min，在酶標(biāo)儀490 nm波長下檢測吸光度(absorbance，A)值，計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

2.4.2 心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px、LDH活性及MDA水平檢測 取分離培養(yǎng)72 h的原代心肌細(xì)胞，以5×105/mL的密度接種于6孔板，分組同“2.3”項(xiàng)，用樣品勻漿液分別提取細(xì)胞，取上清液，根據(jù)試劑盒操作，測定各組細(xì)胞中LDH、SOD、GSH-Px及MDA的A值，計(jì)算LDH、SOD和GSH-Px酶活性及MDA水平。

2.4.3 心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 參考文獻(xiàn)[8]用免疫熒光染色法觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)。取分離培養(yǎng)72 h的原代心肌細(xì)胞，以3×105/mL的密度接種于6孔板，分組及處理同“2.4.1”項(xiàng)。經(jīng)處理后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，每孔加入Hoechst 33258染色液，室溫下避光染色5 min；倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.4 心肌細(xì)胞凋亡率檢測 取分離培養(yǎng)72 h原代心肌細(xì)胞，按1×106/mL的密度接種于6孔板，分組及處理同“2.4.1”項(xiàng)。經(jīng)處理后，按Annexin Ⅴ-FITC/PI檢測試劑盒進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測，檢測結(jié)果用Flow Jo 7.6 軟件分析。

2.4.5 心肌細(xì)胞氧自由基水平測定 取分離培養(yǎng)72 h原代心肌細(xì)胞，以5×105/mL接種于6孔板，分組及處理同“2.4.1”項(xiàng)。各組細(xì)胞經(jīng)處理后，加入DCFH-DA(10 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測，檢測結(jié)果用Flow Jo 7.6軟件分析。

3 結(jié)果

3.1 原代心肌細(xì)胞觀察與鑒定 分離培養(yǎng)24 h后心肌細(xì)胞開始貼壁生長，由散在圓形變?yōu)樗笮巍ＩL至72 h，可見細(xì)胞交互成網(wǎng)。Cy3標(biāo)記的α-actin蛋白在心肌細(xì)胞胞漿中表達(dá)，染色呈紅色(圖1A)；細(xì)胞核染色后發(fā)出藍(lán)色熒光(圖1B)，兩圖合成，心肌細(xì)胞的陽性率大于90%(圖1C)。

注:A.α-actin特異性蛋白表達(dá);B.Hoechst 33258染色的細(xì)胞核;C.A圖和B圖的合成圖

圖1免疫熒光化學(xué)染色法鑒定心肌細(xì)胞(10×20倍)

3.2 對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷心肌細(xì)胞活力的影響 與正常對照組比較，H2O2模型組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)；與H2O2模型組比較，各苓桂術(shù)甘湯含藥血清組心肌細(xì)胞活力均明顯增強(qiáng)(P<0.05)；苓桂術(shù)甘湯含藥血清組間細(xì)胞活力比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明苓桂術(shù)甘湯含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。見表1。

3.3 苓桂術(shù)甘湯含藥血清對H2O2損傷的心肌細(xì)胞LDH、SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響 與正常對照組比較，H2O2模型組SOD及GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)，MDA水平及LDH活性顯著增加(P<0.05)。與H2O2模型組比較，苓桂術(shù)甘湯含藥血清組心肌細(xì)胞SOD及GSH-Px活性明顯增加，LDH活性及MDA水平顯著降低(P<0.05)。表明苓桂術(shù)甘湯含藥血清能抑制心肌細(xì)胞MDA生成及LDH活性，提高SOD及GSH-Px活性，且具有濃度依賴性，對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。見圖2。

表1 苓桂術(shù)甘湯含藥血清對H2O2損傷心肌細(xì)胞活力的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05；與5%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組比較，△P<0.05；與10%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組比較，◇P<0.05

注：A.正常對照組；B. H2O2模型組；C. 20%空白大鼠血清組；D. 5%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；E. 10%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；F. 20%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05；與5%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組比較，△P<0.05；與10%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組比較，◇P<0.05

3.4 苓桂術(shù)甘湯含藥血清對H2O2損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響

3.4.1 苓桂術(shù)甘湯含藥血清對凋亡心肌細(xì)胞形態(tài)的影響 熒光顯微鏡下正常對照組心肌細(xì)胞核質(zhì)均勻、形狀為橢圓形且呈較弱的藍(lán)色熒光；與正常對照組比較，H2O2模型組心肌細(xì)胞的核濃染、熒光增強(qiáng)、顏色發(fā)白，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞特征；與H2O2模型組比較，苓桂術(shù)甘湯含藥血清(10%、20%)組熒光強(qiáng)度減弱、核染色變淺。表明苓桂術(shù)甘湯含藥血清能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。見圖3。

注：A.正常對照組；B. H2O2模型組；C. 20%空白大鼠血清組；D. 5%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；E. 10%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；F. 20%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組

圖3苓桂術(shù)甘湯含藥血清對H2O2損傷的心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響(Hoechst 33258染色，10×20倍)

3.4.2 苓桂術(shù)甘湯含藥血清對H2O2損傷的心肌細(xì)胞凋亡率的影響 與正常對照組比較，H2O2模型組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2模型組比較，苓桂術(shù)甘湯含藥血清組細(xì)胞凋亡率均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，苓桂術(shù)甘湯含藥血清各組之間細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明苓桂術(shù)甘湯含藥血清可抑制H2O2損傷的心肌細(xì)胞凋亡。見圖4。

3.5 苓桂術(shù)甘湯含藥血清對H2O2損傷的心肌細(xì)胞氧自由基水平的影響 與正常對照組比較，H2O2模型組心肌細(xì)胞中氧自由基水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2模型組比較，苓桂術(shù)甘湯各含藥血清組心肌細(xì)胞氧自由基水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苓桂術(shù)甘湯含藥血清各組之間氧自由基水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明苓桂術(shù)甘湯含藥血清能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧自由基的釋放，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。見圖5。

4 討論

心室重構(gòu)是AMI后常見的進(jìn)行性病理過程，與心律失常、心力衰竭等不良預(yù)后密切相關(guān)[9]，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心室重構(gòu)和心力衰竭的重要因素[10]。研究表明，在缺血低氧條件下，氧自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)失衡，活性氧產(chǎn)生的速率大于被清除的速率，造成氧自由基的蓄積，氧自由基對細(xì)胞產(chǎn)生直接的損害，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡而促進(jìn)心室重構(gòu)的發(fā)生[2-3，11]。

注：A.正常對照組；B. H2O2模型組；C. 20%空白大鼠血清組；D. 5%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；E. 10%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；F. 20%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05；與5%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組比較，△P<0.05；與10%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組比較，◇P<0.05

氧自由基和MDA是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，其水平的高低反映細(xì)胞受自由基攻擊和損傷的程度[12]。H2O2是體內(nèi)氧自由基的一種，能自由通過細(xì)胞膜，與胞內(nèi)的鐵離子反應(yīng)生成羥自由基等活性更強(qiáng)的自由基[13]，進(jìn)而改變抗氧化酶的活性和細(xì)胞膜的通透性。GSH-Px和SOD是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，GSH-Px可促進(jìn)H2O2分解為O2和H2O，SOD可清除體內(nèi)積聚的氧自由基，與氧化應(yīng)激水平呈負(fù)相關(guān)。LDH是細(xì)胞內(nèi)的糖酵解酶，廣泛存在于細(xì)胞漿內(nèi)，LDH漏出增加提示細(xì)胞遭到破壞或細(xì)胞膜通透性增加，其漏出量反映細(xì)胞膜的受損程度[14-15]。

注：A.正常對照組；B. H2O2模型組；C. 20%空白大鼠血清組；D. 5%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；E. 10%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；F. 20%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組；與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05；與5%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組比較，△P<0.05；與10%苓桂術(shù)甘湯含藥血清組比較，◇P<0.05

本研究顯示，在H2O2作用下，心肌細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞GSH-Px和SOD活性顯著下調(diào)，LDH活性和MDA、氧自由基水平明顯上調(diào)，細(xì)胞核濃染數(shù)目增加，細(xì)胞凋亡率明顯升高，表明H2O2造成了心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡；而苓桂術(shù)甘湯則能夠提升H2O2誘導(dǎo)損傷模型心肌細(xì)胞GSH-Px、SOD的活性，降低細(xì)胞MDA、氧自由基水平和LDH活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力，提示苓桂術(shù)甘湯可通過提升抗氧化酶活性，提高細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除效率，改善H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。

綜上所述，本研究證實(shí)苓桂術(shù)甘湯可通過改善氧化應(yīng)激水平而有效抑制心肌細(xì)胞損傷和凋亡，這一過程與苓桂術(shù)甘湯增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化酶活性和抑制細(xì)胞膜損傷有關(guān)，但其作用的具體途徑尚不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。