程 婕，儲(chǔ)全根，儲(chǔ) 俊，劉小雙，軒 云，蔡正銀

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

葛花解酲湯出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》，為“解酒化積”之名方[1]。本課題組既往對(duì)該方的解酒作用進(jìn)行了初步研究[2]，鑒于該方組成中有不屬于藥食兩用的中藥，筆者對(duì)原方中的這些藥物進(jìn)行去除，加上屬于藥食兩用且傳統(tǒng)上認(rèn)為具有解酒作用的枳椇子，組成加減葛花解酲湯，進(jìn)一步觀察該方對(duì)急性乙醇中毒小鼠的“解酒”作用，并檢測(cè)血液中乙醇含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，以了解其對(duì)急性乙醇中毒的干預(yù)作用及部分作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種雄性小鼠100只，體質(zhì)量為18～22 g，均為清潔級(jí)，檢疫合格，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2007-001]提供。動(dòng)物可自行攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔用水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理要求。

1.2 藥物 56度紅星二鍋頭白酒：北京紅星股份有限公司；全部中藥均購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂門診部，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山鑒定。

1.3 試劑 SOD測(cè)定試劑盒、MDA試劑盒：均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；無(wú)水乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器 臺(tái)式高速離心機(jī)(型號(hào)為TG16-W)：長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；電熱恒溫水槽(型號(hào)：DK-8D)：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌器(型號(hào)：SVM30H)：上海申安醫(yī)療器械廠；電子天平(型號(hào)：AL204)：梅特勒-托利儀器(上海)有限公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：MB-530)：深圳惠松有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀(型號(hào)：GC456-SQ)：美國(guó)布魯克·道爾頓公司。

2 方法

2.1 中藥制劑的制備 本方由木葛花、枳椇子、縮砂仁、白豆蔻各20 g，白茯苓、橘皮、人參各6 g等組成，以10倍量的水浸泡2 h，煮沸1 h，濾過(guò)，藥渣再用8倍量的水煮沸1 h，濾過(guò)，合并二次濾液，濃縮成含生藥1 g/mL，此為中濃度組；高濃度組進(jìn)行二次濃縮使之含生藥量2 g/mL，低濃度組加入等量蒸餾水稀釋成含生藥量0.5 g/mL；裝瓶，0～4 ℃冰箱放置，保存以備灌胃用。

2.2 小鼠致醉給酒量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[3]，將昆明種雄性小鼠20只，隨機(jī)分成5組，每組4只，禁食12 h后，采取灌胃給酒的方式，給酒量設(shè)立5個(gè)梯度15、16、18、20、22 mL/kg，記錄小鼠的醉倒率和死亡率。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將40只昆明種雄性小鼠隨機(jī)分為5組(正常組，模型組，加減葛花解酲湯低、中、高劑量組)，每組8只，各組均以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各組小鼠禁食、禁水12 h，正常組正常飲食，模型組按照16 mL/kg劑量灌胃56度紅星二鍋頭白酒，加減葛根解酲湯低、中、高劑量組先按照20 mL/kg體質(zhì)量灌胃低、中、高濃度加減葛花解酲湯，30 min后再按照16 mL/kg劑量灌胃56度紅星二鍋頭白酒，正常組予以等量蒸餾水灌胃。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 醉酒的行為學(xué)測(cè)定 觀察記錄各組小鼠(除正常組外)醉酒耐受時(shí)間(從灌酒到翻正反射消失的時(shí)間)，維持時(shí)間(翻正反射消失持續(xù)時(shí)間)，計(jì)算醉倒率。小鼠醉酒與否，以翻正反射是否消失為標(biāo)準(zhǔn)，即小鼠灌酒后將其背向下，輕輕放入鼠籠，若小鼠背向下的姿勢(shì)保持30 s以上，則認(rèn)為翻正反射消失，即認(rèn)定為醉酒。

2.4.2 生化指標(biāo)測(cè)定 灌胃給酒后0.5 h取血樣。取0.5 mL全血采用氣相色譜法測(cè)定乙醇濃度。每組8只小鼠摘眼球取血處死，無(wú)菌取肝。將肝組織置于生理鹽水中機(jī)械勻漿制成肝組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定肝組織SOD、MDA活性。

3 結(jié)果

3.1 小鼠致醉酒量的測(cè)定 給酒量為20、22 mL/kg時(shí)，雖然小鼠的醉倒率達(dá)到100%，但同時(shí)死亡率也為100%。當(dāng)給酒量為18 mL/kg時(shí)，小鼠的醉倒率為75%，死亡率高達(dá)50%，而當(dāng)給酒量為16 mL/kg時(shí)，小鼠的醉倒率為75%，死亡率為0。為使得后續(xù)實(shí)驗(yàn)得以完成，故選擇16 mL/kg為56度白酒的最佳致醉給酒量。

3.2 各組小鼠翻正反射實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與模型組比較，加減葛花解酲湯各治療組小鼠耐受時(shí)間均明顯延長(zhǎng)(P<0.05)、維持時(shí)間均明顯縮短(P<0.05)；且以加減葛花解酲湯高劑量組小鼠耐受時(shí)間最長(zhǎng)(P<0.05)，維持時(shí)間最短(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠翻正反射實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與模型組比較，#P<0.05；與加減葛花解酲湯低劑量組比較，△P<0.05；與加減葛花解酲湯中劑量組比較，◇P<0.05

3.3 各組小鼠全血中乙醇濃度比較 與模型組比較，加減葛花解酲湯低、中、高劑量組小鼠全血乙醇濃度明顯降低(P<0.05)，且隨著劑量的增加，小鼠血液中乙醇濃度呈遞減性降低。見表2。

表2 各組小鼠全血中乙醇濃度比較

注：與模型組比較，#P<0.05

3.4 各組小鼠肝組織中SOD、MDA水平比較 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD水平顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，加減葛花解酲湯中、高劑量組小鼠肝組織中SOD水平顯著升高(P<0.05)，高劑量組MDA水平顯著降低(P<0.05)，加減葛花解酲湯升高SOD和降低MDA的作用具有明顯的劑量依賴性。見表3。

表3 各組對(duì)小鼠肝組織SOD、MDA水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，◇P<0.05

4 討論

酒精的主要化學(xué)成分是乙醇，乙醇在體內(nèi)可直接擴(kuò)散進(jìn)入血液，隨血液流向各個(gè)組織器官，大約有95%的乙醇通過(guò)肝臟代謝[4]，僅有2%～10%由呼吸道、尿液和汗腺以原形排出體外。醉酒，醫(yī)學(xué)上稱為急性乙醇中毒，是由于血液中過(guò)高濃度的乙醇短時(shí)間內(nèi)大量進(jìn)入腦內(nèi)，抑制大腦皮質(zhì)，使皮質(zhì)下中樞失去控制，中樞神經(jīng)細(xì)胞對(duì)各種信息的反應(yīng)和傳遞發(fā)生障礙而產(chǎn)生的一系列病理變化[5]。當(dāng)乙醇進(jìn)入肝細(xì)胞后，通過(guò)代謝氧化成乙醛，在黃嘌呤氧化酶的作用下，乙醛轉(zhuǎn)變成超氧化物和自由基，機(jī)體的氧化應(yīng)激平衡受到破壞，體內(nèi)SOD等抗氧化酶被破壞，從而無(wú)法清除過(guò)量自由基時(shí)，就會(huì)造成廣泛的肝細(xì)胞損傷[6]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，可作用于核因子NF-kB，使致炎因子基因表達(dá)釋放增加，還可使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生障礙，導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能損害，形成機(jī)體的自由基損傷[7]。

為了更好地研究葛花解酲湯的解酒作用并探討其作用機(jī)制，筆者在葛花解酲湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行加減，去除了非藥食同源的藥物。全方以葛花與枳椇子為君，兩藥均入陽(yáng)明，葛花芳香化濕，解酒醒脾，令濕熱從肌肉而出；《本草拾遺》載有“枳椇子，止渴除煩，去膈上熱，潤(rùn)五臟，利大小便”。白茯苓淡利滲濕，能驅(qū)酒濕之邪從小便而出?？s砂仁、白豆蔻溫中健脾，行氣消滯。諸藥合用，共成解酒化積、分消化濕、健脾和胃之劑?，F(xiàn)代研究表明，葛花提取物能使灌酒后的雄性大鼠血液乙醇濃度明顯下降，主要是葛花中含有的大豆苷及大豆苷元能有效減輕乙醇對(duì)大腦的抑制作用[8]。HAN等[9]認(rèn)為，灌胃給予葛花提取物葛花苷或腹腔注射其代謝產(chǎn)物葛花苷均能降低乙醇中毒大鼠血液中乙醇的濃度及死亡率。現(xiàn)代藥理研究表明，三萜類和黃酮類化合物是枳椇子的主要活性成分，具有抗甜味、抑制組胺釋放和保肝解酒等作用[10-12]。柳海艷等[13]發(fā)現(xiàn)，枳椇子提取物可能通過(guò)增加體內(nèi)抗氧化物如維生素C、維生素E和維生素A的含量，從而達(dá)到增加SOD活力的作用。

本次結(jié)果表明，加減葛花解酲湯能明顯降低小鼠血液中乙醇含量，這與本課題組既往研究成果[2]一致，說(shuō)明加減的藥物并沒有影響其作用效果，方劑可以進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。同時(shí)加減葛花解酲湯可下調(diào)肝組織中MDA水平、升高SOD的活力，能增強(qiáng)小鼠體內(nèi)清除氧自由基的能力，推測(cè)此可能是其保護(hù)肝細(xì)胞損傷的部分機(jī)制，這與毛中伏等[14]研究的解酒中藥復(fù)方“肝易復(fù)”對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)為加減葛花解酲湯的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。