豬圓環(huán)病毒3型夾心ELISA診斷方法的建立

于俊楠 陳 媛 彭堯舜 金宜順 羅莉妍 陳梅芳

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350002)

豬圓環(huán)病毒3型 （Porcine circovirus serum type 3，PCV3）是新發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒，二十面體結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，直徑17～20 nm[1]。2016年在美國(guó)首先報(bào)道該病毒的存在[2-3]，隨后陸續(xù)有報(bào)道顯示PCV3型病毒也廣泛存在我國(guó)境內(nèi)[4]。綜合國(guó)內(nèi)外報(bào)道，該病毒與心臟和多系統(tǒng)疾病、豬皮炎腎炎綜合征、繁殖障礙類(lèi) 疾病存在密切聯(lián)系[2-3,5]。PCV3和PCV2衣殼蛋白Cap同源性?xún)H為30%左右[6]，現(xiàn)有的PCV2疫苗無(wú)法對(duì)PCV3進(jìn)行有效防控，PCV3對(duì)生豬養(yǎng)殖所造成的損失進(jìn)一步加大，有效地檢測(cè)場(chǎng)內(nèi)的PCV3感染率是對(duì)其進(jìn)行防治的首要任務(wù)。

ELISA方法是市場(chǎng)應(yīng)用面極大的一項(xiàng)血清學(xué)診斷技術(shù)，其原理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、靈敏、快速，適用于大量樣品的檢測(cè)，從抗原性和結(jié)構(gòu)上可知，PCV2和PCV3不具有交叉免疫保護(hù)的特性。Cap蛋白作為PCV3的主要抗原性攜帶的結(jié)構(gòu)蛋白，使其成為在血清學(xué)上檢測(cè)PCV3的理想抗原。為滿(mǎn)足生產(chǎn)上大批量、低成本、快速的檢測(cè)需求，本研究將重組PCV3 Cap蛋白的單克隆抗體作為包被抗體，以抗Cap蛋白兔多抗為檢測(cè)抗體，優(yōu)化反應(yīng)條件構(gòu)建檢測(cè)PCV3的夾心ELISA方法。測(cè)試該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的目標(biāo)。臨床檢測(cè)結(jié)果良好，該診斷方法的建立對(duì)于PCV3的快速診斷具有很大意義。

1 材料與方法

1.1 病毒、試劑、儀器 已純化的PCV3重組Cap蛋白（18 μg/mL）、PCV3 Cap 蛋白單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存，豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）及 PCV2 Cap 蛋白均由實(shí)驗(yàn)室制備保存；新西蘭黃兔從福建農(nóng)林大學(xué)兔園購(gòu)買(mǎi)；碳酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)買(mǎi)自武漢賽威生物技術(shù)有限公司；Tween-20購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ELISA相關(guān)試劑、羊抗兔HRP-IgG、酶標(biāo)板均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MultiskanGo新一代全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo）。

1.2 單克隆抗體的純化 在-80℃下取出抗Cap單抗腹水，并通過(guò)硫酸銨-辛酸沉淀法進(jìn)行純化[7]：調(diào)節(jié)腹水pH至4.8；加入1/25體積辛酸并攪拌；靜置離心，取上清調(diào)節(jié)pH至7.2，50%硫酸銨沉淀，將沉淀溶解在PBS中，再用45%硫酸銨二次沉淀，PBS溶解沉淀，透析過(guò)夜；離心取上清，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并稀釋至工作濃度。

1.3 兔多克隆抗體制備與測(cè)定 將Cap蛋白與完全弗氏佐劑混合（比例為1∶1），皮下注射新西蘭黃兔（首次免疫），15 d后進(jìn)行第二次免疫，該程序與第一次免疫相同。二免15 d后，改用不完全弗氏佐劑和Cap蛋白1∶1重新混合進(jìn)行再次免疫，免疫5 d后收集兔血清，收集空白組兔血液作為陰性對(duì)照，間接ELISA測(cè)定陽(yáng)性血清效價(jià)。

1.4 單抗最佳包被濃度的確定 將純化的單抗用包 被 液 稀 釋 至 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 包 被 于ELISA 板中，100 μL/孔，重復(fù) 3次，并在 4℃冰箱保存過(guò)夜；第2 d倒出板中的液體，用含有0.05%吐溫的PBS沖洗，拍干孔內(nèi)液體，再次加入100 μL封閉液，在濕盒中 37 ℃下封閉 l h；洗滌；加入 100 μL（1∶20）待檢樣品，37℃濕盒孵育1 h；洗滌；各孔加入100 μL （1∶4 000）PCV3 陽(yáng)性血清，37 ℃濕盒孵育1 h；洗滌；將稀釋后的羊抗兔 HRP-IgG（1∶5 000）加入 ELISA 板中，100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育 l h；洗滌； 加底物 TMB 顯色液 （100 μL/孔），37℃顯色20 min；向各孔加入100 μL終止液，15 min內(nèi)在酶標(biāo)儀中測(cè)OD450值；根據(jù)各孔OD值計(jì)算P/N值，判讀結(jié)果。

1.5 包被條件的選擇 鎖定試劑最佳作用濃度，其他條件均不改變的前提下，同一時(shí)間段進(jìn)行兩組包被條件的選擇（4℃過(guò)夜，37℃、2 h）。

1.6 一抗最佳作用濃度的確定 保持單抗包被濃度 不 變 ，PCV3 陽(yáng) 性 血 清 按 照 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000 的比例稀釋?zhuān)渌僮魍?1.4。

1.7 酶標(biāo)二抗最佳作用濃度的確定 保持單抗包被濃度、PCV3陽(yáng)性血清作用濃度不變，將羊抗兔HRP-IgG 按 1∶5 000、1∶10 000 兩個(gè)梯度進(jìn)行操作，其他操作同1.4，讀取OD450nm值選擇酶標(biāo)二抗最佳作用濃度。

1.8 臨界值判定 使用建立的夾心ELISA方法，檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室制備的28份豬PCV3陰性樣品的OD450值。計(jì)算平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，陽(yáng)性臨界OD450值≥X+3SD；陰性臨界OD450值≤X+2SD，介于之間者判定為可疑。

1.9 特異性試驗(yàn) 使用建立的夾心ELISA方法檢測(cè)豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬偽狂犬病病毒 （PRV）、PCV2和PCV3陽(yáng)性樣本，測(cè)試建立的夾心ELISA方法的特異性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 用制備的同批次和不同批次的包被板，不同時(shí)間檢測(cè)3種不同梯度的陽(yáng)性樣品，每組樣品進(jìn)行3組重復(fù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，并分析組內(nèi)和組間重復(fù)性。

1.11 臨床應(yīng)用 建立的夾心ELISA診斷方法和現(xiàn)有的PCR診斷方法同時(shí)用于檢測(cè)收集的19份不同豬的不同組織，比較兩種方法的測(cè)試結(jié)果，并評(píng)估該方法的臨床適用性。

2 結(jié) 果

2.1 單抗純化 辛酸-硫酸銨蛋白沉淀法純化之后，測(cè)定蛋白含量為1.2 mg/mL，用PBS稀釋至1 mg/mL，分裝保存，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 兔多抗血清的制備與鑒定 最后一次注射3 d后收集血清，通過(guò)間接ELISA測(cè)定效價(jià)達(dá)到1∶16 000，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

2.3 夾心ELISA最佳工作條件的確定 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，固定重組蛋白液的稀釋比例為 1∶20，即 0.9 μg/mL?？刂瓢豢贵w作為單一變量，將P/N最大值的包被量（10 μg/mL）定為最佳濃度，結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 單抗包被濃度篩選結(jié)果

以最佳包被濃度包被單抗，控制一抗作為單一變量，結(jié)果見(jiàn)表3，確定一抗最佳稀釋濃度為1∶4 000，此時(shí)陽(yáng)性對(duì)照OD450值最接近1。

表1 兔豬陽(yáng)性血清抗體效價(jià)檢測(cè)

表3 一抗最佳作用濃度結(jié)果

在先前確定濃度的基礎(chǔ)上，將酶標(biāo)二抗羊抗兔HRP-IgG 分 1∶5 000、1∶10 000 進(jìn)行對(duì)比， 推薦使用量1∶5 000更為合適，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 羊抗兔IgG濃度篩選結(jié)果

按照最佳試劑作用濃度，改變包被條件。表5試驗(yàn)結(jié)果顯示，包被條件4℃過(guò)夜略?xún)?yōu)于37℃、2 h。

表5 包被條件篩選結(jié)果

2.4 臨界值判定 通過(guò)對(duì)28份陰性樣品的測(cè)試，測(cè)得450 nm下的OD值，計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果顯示平均值為0.2048，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0687。以X+3SD為陽(yáng)性臨界，X+2SD為陰性臨界。即OD值超過(guò)0.4110為陽(yáng)性，低于0.3423為陰性，介于0.3423～0.4110為可疑。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。

2.5 特異性試驗(yàn) 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、PCV2和PCV3蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表7，未發(fā)現(xiàn)該方法存在交叉反應(yīng)，無(wú)關(guān)病毒檢測(cè)陰性，該方法有良好的特異性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 用制備的同批次和不同批次的包被板，不同時(shí)間檢測(cè)3種不同梯度的陽(yáng)性樣品，每組樣品進(jìn)行3組重復(fù)，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，分析其組內(nèi)和組間重復(fù)性。結(jié)果顯示該方法可重復(fù)性良好，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均處于5%內(nèi)。具體結(jié)果見(jiàn)表8-表9。

2.7 臨床應(yīng)用 用建立的夾心ELISA診斷方法和已有的PCR診斷方法分別對(duì)采集的19份不同豬不同組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表9。建立的夾心ELISA方法檢測(cè)出11份陽(yáng)性；而PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性13份，陰性6份，該診斷方法與PCR方法符合率達(dá)到84.6%，總體效果仍然相對(duì)比較理想。結(jié)果也表明淋巴結(jié)樣品OD值高于同源其他組織樣品，推測(cè)所含病毒量較其他組織會(huì)有差異。

表6 28份陰性樣品測(cè)試結(jié)果

表7 夾心ELISA特異性檢測(cè)結(jié)果

表8 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表9 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表10 兩種方法臨床檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

PCV3對(duì)生豬養(yǎng)殖行業(yè)的危害日趨加重，對(duì)其防治也逐漸為各國(guó)所重視，目前對(duì)于PCV3的檢測(cè)手段有僅限于分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有成功分離病原的報(bào)告[4]。也只有ELISA檢測(cè)對(duì)試驗(yàn)條件要求較低，庫(kù)旭剛等[8]針對(duì)PCV3的ORF2基因表達(dá)進(jìn)行間接ELISA方法的建立，宋長(zhǎng)緒[9]申請(qǐng)間接ELISA檢測(cè)試劑盒專(zhuān)利，都是圍繞間接ELISA方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

對(duì)于圓環(huán)2型病毒，有進(jìn)行夾心ELISA診斷方法建立的先例[10]，故PCV3的夾心ELISA也具有實(shí)踐可行性。本試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室制備的抗Cap蛋白單抗隆抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)有很多可以提高檢測(cè)結(jié)果可靠度的操作。在洗滌操作中，洗滌五次的同時(shí)加大洗滌液的用量，可以很好地將離散度控制下來(lái)；同時(shí)在對(duì)不同組織的檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)，不同組織檢測(cè)的OD值存在差異，推測(cè)不同組織的含毒量會(huì)有所不同，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，基于最佳反應(yīng)條件下夾心ELISA檢測(cè)方法的特異性、靈敏性和可重復(fù)性，在臨床初步測(cè)試中表現(xiàn)良好，與PCR符合率達(dá)到84.6%。對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查、豬場(chǎng)的一般檢測(cè)具有一定的意義。