喬中全，王曉明， ，李永欣，曾慧杰，蔡 能，劉思思，陳 藝

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2.林木無(wú)性系育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

紫薇(LagerstroemiaindicaL.)為千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬(Lagerstroemia)落葉灌木或小喬木[1]。其花色艷麗、樹姿優(yōu)美，具有花期長(zhǎng)、抗污染等優(yōu)點(diǎn)，深受人們的喜愛，在我國(guó)已有1 500多年的栽培歷史，全國(guó)各地均有種植，是夏季重要觀賞樹木。

紫薇原產(chǎn)中國(guó)，150 a前從亞洲被引種到美國(guó)南部，采取雜交育種與選擇育種相結(jié)合、誘變育種輔以選擇育種等手段，開始了國(guó)外紫薇屬植物的育種研究工作[2]。通過(guò)紫薇種內(nèi)雜交培育出Catawba等6個(gè)耐白粉病紫薇品種。引進(jìn)有抗白粉病特性的屋久島紫薇(L.faurieiKoehne)，將其與紫薇進(jìn)行雜交，利用種間雜交先后選育出Miami等20多個(gè)抗白粉病紫薇品種[3]。通過(guò)化學(xué)誘變劑甲磺酸乙酯(EMS)對(duì)紫薇種子進(jìn)行誘變，獲得了Dynamite、Red Rocket等8個(gè)顏色鮮紅、復(fù)色花且可持續(xù)開花的優(yōu)良紫薇品種[2]。自1965年至2017年9月底，美國(guó)共有94個(gè)紫薇品種獲得專利，從地域上看，這些品種大多在美國(guó)南部和東南部地區(qū)選育[4]。

楊彥伶等[5]和張亞東等[6]利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)技術(shù)分析了不同花色野生紫薇間的遺傳多樣性。王獻(xiàn)等[7-8]首次完成了紫薇的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)銀染反應(yīng)體系，并建立了相關(guān)種的AFLP指紋圖譜，利用該技術(shù)確定了部分紫薇品種間的親緣關(guān)系。顧翠花等[9-10]對(duì)紫薇的AFLP技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，利用優(yōu)化后的AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析了福建紫薇、南紫薇及其雜交后代的親緣關(guān)系。徐靜靜等[11]利用ISSR技術(shù)對(duì)4個(gè)紫薇群體、48個(gè)不同花色的紫薇材料進(jìn)行分析，證實(shí)了4個(gè)群體的花色遺傳多樣性。賀丹等[12]對(duì)尾葉紫薇和香雪云雜交后代進(jìn)行表型分析和SSR標(biāo)記的連鎖分析，證明5個(gè)表型性狀在群體中分布呈連續(xù)性，且彼此間呈現(xiàn)相關(guān)性。這些研究在紫薇品種鑒定、分類、遺傳多樣性和評(píng)價(jià)等方面取得了一定進(jìn)展，但以往研究多以野生種質(zhì)或國(guó)內(nèi)品種為研究對(duì)象，而對(duì)國(guó)外引進(jìn)品種及其相互間親緣關(guān)系研究較少。本研究對(duì)來(lái)自中國(guó)和美國(guó)的不同花色、葉色、株型的紫薇品種進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)標(biāo)記研究，以期深入了解不同來(lái)源紫薇品種的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 植物材料

38份供試材料取自湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場(chǎng)紫薇種質(zhì)資源圃(表1)。編號(hào)1～30為美國(guó)引進(jìn)品種，其中編號(hào)1為不育品種，編號(hào)19～23葉色紫紅色，編號(hào)24花復(fù)色。編號(hào)31～38為國(guó)內(nèi)品種，其中，編號(hào)31為抗寒品種，在北京地區(qū)可安全過(guò)冬，編號(hào)32為完全不育品種，這2個(gè)品種已通過(guò)國(guó)家植物新品種審定；編號(hào)36為速生紫薇，編號(hào)38為矮化品種。

樣品采集方法：在選定的植株上隨機(jī)采集數(shù)片嫩葉，用冰袋帶回實(shí)驗(yàn)室，用雙蒸水沖洗干凈，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 基因組DNA提取

采用改良的CTAB法[13](4% CTAB，1.4 mol·L-1NaCl， 0.1 mol·L-1Tris-HCl、pH 8.0，0.02 mol·L-1EDTA、pH 8.0，2% β-巰基乙醇)提取紫薇葉片中的基因組DNA，樣品研磨過(guò)程中加入2% PVP粉末。使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。

1.3 引物篩選與PCR擴(kuò)增

所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC primer set No. 9， University of British Columbia， Canada， http:// www. ubc. ca)公布的植物通用ISSR引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。從100條引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的10條引物(表2)。

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：30 ng DNA模板(1 μL)，1.5 UTaqDNA聚合酶(0.2 μL)，0.60 μmol·L-1引物(1 μL)，0.20 mmol·L-1dNTPs(2 μL)，10×PCR buffer Mg2+free (4 μL)、2.0 mmol·L-1MgCl2(1.4 μL)，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，47～59 ℃退火(不同引物有其特異退火溫度)30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。1×TAE緩沖液、1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)引物，使用BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

選擇清晰度高、重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析，把每條帶作為1個(gè)等位基因，有條帶記1，無(wú)條帶記0[14]，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。使用分析軟件NTsys2.10e進(jìn)行遺傳相似性分析和UPGMA聚類分析。用Popgene32計(jì)算不同品種間的基因多樣性、Shannon信息指數(shù)、總體基因多樣性等。用NTsys2.10e軟件[15]進(jìn)行遺傳相似系數(shù)分析。采用Nei-Li相似系數(shù)法[16]，計(jì)算各個(gè)材料間的遺傳相似系數(shù)I和遺傳距離D，I=2mxy·mx-1+my，D=1-I，其中mxy為第x個(gè)材料和第y個(gè)材料共有的條帶數(shù)，mx和my分別為第x個(gè)材料和第y個(gè)材料各自的總擴(kuò)增帶數(shù)，并用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

表1供試材料

Table1Experiment material

代碼Code名稱Name品種來(lái)源Sources品種特性Characteristics1Double Feature美國(guó)America花深紅色,育性低 Flowers are dark red, low fertility2Bradberry Wine美國(guó)America花深紫紅色 Flowers are deep red-purple3Catawba美國(guó)America 花深紫色 Flowers are deep purple4Siren Red美國(guó) America 花深紅色,嫩葉紫紅色 Flowers are dark red and young leaves are red-purple5Burgundy Cotton美國(guó) America花白色、略帶紅色,嫩葉紫紅色Flowers are white, slightly reddish and young leaves are red-purple6Red Rooste美國(guó) America 花大紅色 Flowers are deep red7Red Filli美國(guó) America 花大紅色,嫩葉紫紅色 Flowers are deep red and young leaves are red-purple8Rhapsody in Pink美國(guó) America 花淺粉紅色,葉片紫色 Flowers are light pink and leaves are purple9Royalty美國(guó) America 花紫色 Flowers are purple10Victor美國(guó) America 花深紅色 Flowers are deep red11Centennial Spirit美國(guó) America 花深紅色 Flowers are deep red12Violet Filli美國(guó) America 花紫藍(lán)色 Flowers are violet blue13Cherry Dazzle美國(guó) America 花大紅色 Flowers are deep red14Berry Dazzle美國(guó) America 花玫紅色 Flowers are rose red15Shawberry Dazzle美國(guó) America 花玫紅色 Flowers are rose red16Miami美國(guó) America 花粉紅色,嫩葉紅色 Flowers are pink and young leaves are red17Purple Magic美國(guó) America 花紫色 Flowers are purple18Coral Magic美國(guó) America 花粉紅色,嫩葉紅色 Flowers are pink and young leaves are red19Best Red美國(guó) America 花大紅色,葉片紫紅色 Flowers are deep red and leaves are red-purple20Crimson Red美國(guó) America 花大紅色,葉片紫紅色 Flowers are deep red and leaves are red-purple21Blush美國(guó) America花白色、略帶粉紅,葉片紫紅色Flowers are white, slightly pink and leaves are red-purple22Pure White美國(guó) America 花純白色,葉片紫紅色 Flowers are white and leaves are red-purple23Red Hot美國(guó) America 花大紅色,葉片紫紅色 Flowers are deep red and leaves are red-purple24Peppermint美國(guó) America 花復(fù)色,玫紅色略帶白邊 Flowers are rose red with white edges25Moonlight Magic美國(guó) America 花白色,葉片紫紅色 Flowers are white and leaves are red-purple26Midnight Magic美國(guó) America 花粉紅色,葉片紫紅色 Flowers are pink and leaves are red-purple27Snow White美國(guó) America 花純白色 Flowers are white28Red Rocket美國(guó) America 花大紅色 Flowers are deep red29Dynamite美國(guó) America 花大紅色、略帶白邊 Flowers are deep red with white edges30pink velour美國(guó) America 花深粉紅色,嫩葉紫紅色 Flowers are deep pink and young leaves are red-purple31曉明1號(hào)Xiaoming No. 1 湖南 Hunan 花大紅色,嫩葉紫紅色 Flowers are deep red, young leaves are red-purple32湘韻 Xiangyun 湖南 Hunan 花粉紅色,完全不育 Flowers are pink and complete infertility33紫云 Ziyun 浙江 Zhejiang 花紫紅色 Flowers are red-purple34溫州紅葉Wenzhou Hongye 浙江 Zhejiang 花淺粉紅色,嫩葉紫紅色 Flowers are light pink and young leaves are red-purple35溫江大紅Wenjiang Dahong 四川 Sichuan 花深粉紅色 Flowers are deep pink36淮南速生Huainan Susheng 江蘇 Jiangsu 花淺粉紅色,葉片大 Flowers are light pink and leaves are large37淮南紅葉Huainan Hongye 江蘇 Jiangsu 花淺粉紅色,嫩葉紅色 Flowers are light pink and young leaves are red38深紫紅矮化Deep purple dwarf 浙江 Zhejiang 花深紫紅色,矮化品種 Flowers are deep red-purple and plant is dwarf

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薇葉片基因組DNA提取

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，提取的紫薇葉片基因組DNA濃度高，完整性好，基本無(wú)蛋白質(zhì)和RNA污染。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

用篩選出來(lái)的10條引物對(duì)38個(gè)紫薇材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出81條分子量在200～2 800 bp的條帶，其中，多態(tài)性條帶數(shù)量為70條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)為86.42%(表2)，每條引物可以擴(kuò)增出6～10個(gè)DNA條帶，平均8.1個(gè)。通過(guò)PopGen32軟件計(jì)算出各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.408 0，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.249 6，Shonnon’s信息指數(shù)(S)為0.386 4。

2.3 品種間親緣關(guān)系

通過(guò)PopGen32軟件進(jìn)行樣品間遺傳相似性系數(shù)的計(jì)算，得出38個(gè)紫薇品種間的Nei’s遺傳相似性系數(shù)介于0.543 2～0.988 7，平均為0.788 2。淮南速生與淮南紅葉之間遺傳相似性系數(shù)最大(0.988 7)，表明兩者親緣關(guān)系比較近。Shawberry Dazzle與溫州紅葉之間遺傳相似性系數(shù)最小(0.543 2)，表明兩者之間遺傳差異較大。

2.4 品種間聚類分析

基于ISSR擴(kuò)增結(jié)果，按UPGMA法分析38個(gè)紫薇品種間的遺傳關(guān)系，得到不同品種間的遺傳關(guān)系樹狀圖(圖1)。在遺傳相似性系數(shù)0.736處可將38個(gè)紫薇品種分為3類群(表3)。

類群Ⅰ均為美國(guó)引進(jìn)品種，在相似性系數(shù)0.760處又可分為3個(gè)亞類，亞類A為紅色系和紫色系品種，包括Double Feature、Royalty、Cherry Dazzle、Violet Filli、Purple Magic、Victor、Berry Dazzle、Shawberry Dazzle、Centennial Spirit、Catawba、Red Rooste，在相似性系數(shù)0.858處2個(gè)紫色品種(Violet Filli、Purple Magic)和2個(gè)玫紅色品種(Berry Dazzle、Shawberry Dazzle)分別聚為一類；亞類B包括Siren Red、Burgundy Cotton、Red Filli、Rhapsody in Pink、Miami、Best Red，嫩葉全部為紫紅色；亞類C包含2個(gè)花色和葉色均不同的紫薇品種(Bradberry Wine、Coral Magic)。

類群Ⅱ包括10個(gè)美國(guó)引進(jìn)品種和7個(gè)國(guó)內(nèi)培育品種，在相似性系數(shù)為0.778處又可分為3個(gè)亞類，其中亞類D包括Crimson Red、Red Hot、Blush、Pure White、Dynamite、pink velour、Peppermint、Midnight Magic、Red Rocket等9個(gè)美國(guó)引進(jìn)品種和湘韻、曉明1號(hào)、深紫紅矮化等3個(gè)國(guó)內(nèi)培育品種，在相似性系數(shù)0.844處3個(gè)紫葉品種(Crimson Red、Red Hot、Blush)聚在一起，矮化品種(深紫紅矮化)單獨(dú)聚為一類；亞類E只包含1個(gè)純白色品種(Snow White)；亞類F包含4個(gè)花色不同的國(guó)內(nèi)培育品種(紫云、淮南速生、淮南紅葉、溫江大紅)。

表2篩選出的ISSR引物及其擴(kuò)增結(jié)果

Table2Selected ISSR primers and their amplification results

引物編號(hào)Primer number引物序列Primer sequence(5’-3’)擴(kuò)增總條帶數(shù)Total number of bands amplified多態(tài)性條帶數(shù)Polymorphism bands多態(tài)性比率Polymorphism ratio/%UBC814CTCTCTCTCTCTCTCTA66100.00UBC824TCTCTCTCTCTCTCTCG99100.00UBC826ACACACACACACACACC10880.00UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT10990.00UBC844CTCTCTCTCTCTCTCTRC8562.50UBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRG8787.50UBC846CACACACACACACACART7571.43UBC847CACACACACACACACARC99100.00UBC879CTTCACTTCACTTCA7685.71UBC899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA7685.71

表338個(gè)紫薇品種的ISSR分類

Table3Classification of 38Lagerstroemiaindicacultivars based on ISSR

類群 Groups品種名 Variety name類群ⅠGroupⅠADouble Feature、Royalty、Cherry Dazzle、Violet Filli、Purple Magic、Victor、Berry Dazzle、Shawberry Dazzle、Centennial Spirit、 Catawba、 Red RoosteBSiren Red、 Burgundy Cotton、 Red Filli、 Rhapsody in Pink、 Miami、Best RedCBradberry Wine 、Coral Magic類群ⅡGroupⅡDCrimson Red、Red Hot、Blush、Pure White、湘韻 Xiangyun、Dynamite、pink velour、曉明1號(hào) Xiaoming No. 1、深紫紅矮化Deep purple dwarf、Peppermint、Midnight Magic、Red RocketESnow WhiteF紫云Ziyun、淮南速生Huainan Susheng、淮南紅葉Huainan Hongye、溫江大紅 Wenjiang Dahong類群Ⅲ GroupⅢMoonlight Magic、溫州紅葉Wenzhou Hongye

圖1 基于ISSR標(biāo)記的38個(gè)紫薇品種的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of 38 Lagerstroemia indica cultivars based on ISSR marker

類群Ⅲ包含1個(gè)白色引進(jìn)品種(Moonlight Magic)和1個(gè)粉紅色國(guó)內(nèi)培育品種(溫州紅葉)。

3 討論

從哥倫比亞大學(xué)公布的100條植物通用ISSR引物中篩選出的10條引物，能在38個(gè)紫薇品種中擴(kuò)增出清晰、多態(tài)性好的條帶，共擴(kuò)增出70個(gè)清晰的多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為86.42%；每條引物平均可以擴(kuò)增出8.1個(gè)條帶，表明ISSR標(biāo)記可以用于紫薇品種的遺傳多樣性分析。

聚類分析表明，來(lái)自相同地理區(qū)域的品種傾向于聚集在一起[17]，來(lái)自美國(guó)的品種主要分布在類群Ⅰ，而中國(guó)栽培品種歸入類群Ⅱ，但也存在一些例外品種，如Pure White、湘韻、Dynamite、pink velour、曉明1號(hào)，它們來(lái)自不同區(qū)域卻聚在一起。曉明1號(hào)是以pink velour為父本，以Dynamite為母本雜交選育出的新品種[18]，因此，可推測(cè)這5個(gè)品種聚集在一起是因?yàn)樗鼈兙哂邢嗨频倪z傳背景。

在集群內(nèi)，存在一些與葉色相對(duì)應(yīng)的子集群，如Siren Red、Burgundy Cotton、Red Filli、Rhapsody in Pink、Miami、Best Red等6個(gè)品種的嫩葉均是紫紅色；Crimson Red、Red Hot、Blush、Pure White等4個(gè)品種的成熟葉均是黑紫色。這些品種除花色不同外，在植株生長(zhǎng)習(xí)性、植株生活型、植株干皮顏色、花萼特征、花芽形狀和花徑大小等形態(tài)特征上幾乎無(wú)差異，因此，在形態(tài)分類上將它們分為一類，ISSR聚類結(jié)果也與此形態(tài)分類一致?；茨霞t葉與淮南速生的遺傳相似系數(shù)為0.988 7，遺傳基礎(chǔ)高度一致，但是2個(gè)品種間形態(tài)差異非常明顯，并非同一個(gè)品種，可能是因?yàn)榛茨纤偕倪z傳物質(zhì)加倍導(dǎo)致，具體原因還需進(jìn)一步研究。

根據(jù)張亞東等[6]、徐靜靜等[11]的研究結(jié)果，L.indica主要按花色聚類，白色聚為一類，紫色聚為一類，但本研究卻不能得出相同結(jié)論。這可能是由于采樣的代表性所致，本研究的實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)過(guò)了詳細(xì)的植物學(xué)性狀調(diào)查，除花色外，其他形態(tài)特征差異也較大。由此可知，不能僅根據(jù)花色來(lái)將紫薇品種分類，這與王獻(xiàn)等[8]的觀點(diǎn)一致。

株型、花萼特征、花色相近的紫薇品種也顯示出了一定的親緣關(guān)系，表明這些表型性狀可作為紫薇品種分類的關(guān)鍵指標(biāo)之一[19]。本研究沒有擴(kuò)增出特征譜帶，未發(fā)現(xiàn)特異的擴(kuò)增片段與紫薇的株型、花色等相關(guān)。另外，紫薇品種的基因型具有高度雜合性，多型性基因位點(diǎn)較多，很難建立基因位點(diǎn)與株型、花色等主要表型性狀之間的聯(lián)系。因此，還需要加大特異性引物的開發(fā)，用于深入分析紫薇品種的遺傳背景。

我國(guó)紫薇種質(zhì)資源非常豐富，紫薇屬植物有18種，但我國(guó)紫薇研究工作起步較晚，較美國(guó)、日本等國(guó)家有一定差距[2]。目前，我國(guó)紫薇品種的自主選育、改良能力不足，國(guó)內(nèi)栽培品種主要從國(guó)外引進(jìn)。在引進(jìn)新品種時(shí)，對(duì)品種(系)的遺傳背景了解甚少，影響后續(xù)紫薇選育工作，嚴(yán)重制約了我國(guó)紫薇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。針對(duì)這些問題，作者認(rèn)為今后應(yīng)加強(qiáng)我國(guó)野生紫薇屬植物資源的開發(fā)力度，積極開展紫薇新品種選育、快繁、栽培和病蟲害防治等工作。在引進(jìn)新品種時(shí)應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分品種(系)，查清其遺傳背景，統(tǒng)一采用拉丁名，不采用商品名。