張博偉，王海靜，宋茂勇，謝慧君，*，張 建

(1.山東大學(xué) 環(huán)境研究院，山東 濟(jì)南 250100； 2.山東大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100； 3.中國(guó)科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085)

四溴雙酚A(TBBPA)是一種溴系阻燃劑，廣泛應(yīng)用于印刷電路板、電子產(chǎn)品、塑料、紡織等工業(yè)產(chǎn)品中[1]。隨著TBBPA的廣泛應(yīng)用，目前它已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)的新興污染物之一。TBBPA在環(huán)境中可以長(zhǎng)期存在，并能長(zhǎng)距離遷移[2]，在不同環(huán)境中均有檢出[3-4]。由于它和甲狀腺激素具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，很容易與甲狀腺激素運(yùn)載蛋白結(jié)合，因此也被視作一種潛在的內(nèi)分泌干擾物[5]，一旦隨生物鏈進(jìn)入人體，會(huì)造成人體正常代謝活動(dòng)的紊亂。TBBPA具有親脂性和疏水性，一旦進(jìn)入環(huán)境，最終會(huì)積聚到土壤中。Xu等[6]檢測(cè)到北京農(nóng)田土壤中TBBPA濃度為0～5.6 μg·kg-1，電子廢物回收地區(qū)土壤中TBBPA濃度高達(dá)26～104 μg·kg-1；研究人員在以色列的一個(gè)污染場(chǎng)地的表層土壤中，檢測(cè)到TBBPA的最高濃度達(dá)450 mg·kg-1[7]。

土壤微生物是土壤的重要組成部分，在土壤物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮重要作用[8]。氮元素是土壤中重要的養(yǎng)分元素之一[9]。土壤生態(tài)系統(tǒng)主要依靠氮轉(zhuǎn)化，如硝化、反硝化、厭氧氨氧化，來(lái)維持土壤生產(chǎn)力和土壤微生物活性。土壤中的微生物硝化、反硝化、厭氧氨氧化過(guò)程，主要以微生物酶的活性決定反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率[10]。有研究表明，As、Be、Br、Cd、Cr、Pb、Hg等重金屬，對(duì)土壤硝化均有不同程度的抑制作用[11]。當(dāng)有機(jī)污染物菲的濃度達(dá)到250 mg·kg-1時(shí)同樣也能抑制土壤硝化作用[10]。雖然土壤微生物在厭氧或者好氧條件下對(duì)TBBPA均有一定的降解作用[12-13]，但當(dāng)TBBPA進(jìn)入土壤后，是否會(huì)對(duì)土壤中無(wú)機(jī)氮循環(huán)相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能造成一定影響，從而影響土壤物質(zhì)循環(huán)，尤其是無(wú)機(jī)氮循環(huán)，在本研究范圍內(nèi)檢索還未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集和微生物分析

實(shí)驗(yàn)土壤選取山東省濟(jì)南市百花公園(117.07°E，36.68°N)的表層土壤(0—20 cm)，設(shè)置3個(gè)5 m×10 m的樣方，用直徑7 cm的螺旋鉆隨機(jī)取10份樣品，將取得的樣品充分混合，去除土壤中的植物殘?jiān)?、?shù)枝殘骸和大塊石頭。處理好的土壤樣品置于陰涼處風(fēng)干后過(guò)10目篩(2 mm)。將過(guò)篩土壤樣品的含水率調(diào)節(jié)為土壤干重的40%，放在托盤(pán)中用保鮮膜包好，放進(jìn)28 °C恒溫培養(yǎng)箱中避光孵化7 d，以增強(qiáng)土壤中微生物的活性。測(cè)得土樣pH值為8.0，總氮(TN)含量為169 mg·kg-1，總碳(TC)含量為2.43 g·kg-1，陽(yáng)離子交換量(CEC)為21.03 cmol·kg-1。

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)TBBPA濃度(4、10、20、40 mg·kg-1)的污染土壤作為實(shí)驗(yàn)組，以不添加TBBPA的土壤樣品作為空白組。配制實(shí)驗(yàn)組土壤時(shí)，首先將TBBPA溶解到甲醇中，配制不同濃度的TBBPA母液，然后按其所需添加量加入土壤中，攪拌均勻后在通風(fēng)櫥放置30 min，以保證甲醇溶劑揮發(fā)完全[14]。所有實(shí)驗(yàn)組和空白組均添加相同體積的甲醇。將溶劑揮發(fā)后的土壤分成30份，每份200 g，加入500 mL的錐形瓶中。

為了更好地了解不同氧氣環(huán)境下TBBPA對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮循環(huán)微生物的影響，將每個(gè)TBBPA濃度處理平均分為厭氧組和好氧組。好氧組分別命名為A-4、A-10、A-20、A-40，厭氧組分別命名為AN-4、AN-10、AN-20和AN-40。此外，好氧組和厭氧組各設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，分別命名為A-CK和AN-CK。好氧組使用棉花塞封口，厭氧組通入氮?dú)夂笥孟鹉z塞封口。將30個(gè)錐形瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 °C條件下培養(yǎng)45 d。

1.2 土壤樣品中銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的測(cè)定

1.3 土壤樣品DNA提取及高通量測(cè)序

取培養(yǎng)45 d后干燥的土壤0.3 g，使用PowerSoil?DNA Isolation kit DNA(MOBIO)試劑盒提取土壤中微生物的DNA。DNA的純度和濃度利用Nanodrops ND-1000 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，合格的DNA樣品保存在-20 ℃冰箱內(nèi)。采用Illumina高通量測(cè)序檢測(cè)TBBPA對(duì)無(wú)機(jī)氮循環(huán)相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。選擇F338和R806引物，對(duì)微生物的16S rRNA基因中V3～V4段進(jìn)行擴(kuò)增，并利用Illumina MiSeq測(cè)序儀器對(duì)16S rRNA基因的擴(kuò)增子進(jìn)行250 bp的末端測(cè)序，測(cè)序后的數(shù)據(jù)處理方法如Kang等[15]所述。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)不同處理下的土壤無(wú)機(jī)氮含量數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)有顯著差異(P<0.05)的處理做最小顯著差異性檢驗(yàn)。利用Origin 9.1軟件繪圖。

高通量數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)篩選后，使用PICRUSt標(biāo)準(zhǔn)化16S rRNA的拷貝數(shù)，并根據(jù)KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)微生物群組的功能[16]，然后篩選出與氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能基因，包括參與硝化、反硝化、厭氧氨氧化過(guò)程的功能基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TBBPA對(duì)于土壤無(wú)機(jī)氮循環(huán)的影響

表1好氧和厭氧條件下不同濃度TBBPA對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮的影響

Table1Effect of different concentrations of TBBPA on inorganic nitrogen in aerobic or anaerobic conditions

條件Condition樣品SampleNH+4-N/(mg·kg-1)NO-2-N/(mg·kg-1)NO-3-N/(mg·kg-1)好氧A-CK0.19±0.03 a0.79±0.15 a0.48±0.01 aAerobicA-40.18±0.00 ab 0.72±0.02 a0.47±0.01 aA-100.17±0.01 ab0.87±0.06 a0.48±0.02 aA-200.17±0.01 ab0.68±0.07 a0.48±0.02 aA-400.11±0.04 b0.65±0.08 a0.27±0.02 b厭氧AN-CK0.39±0.09 a0.87±0.18 a0.41±0.02 bAnaerobicAN-40.41±0.01 a0.65±0.04 a0.44±0.02 bAN-100.43±0.02 a0.65±0.08 a0.49±0.02 bAN-200.43±0.05 a0.76±0.09 a0.42±0.03 bAN-400.44±0.06 a0.65±0.06 a0.55±0.07 a

同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同小寫(xiě)字母的表示差異顯著(P<0.05)。

Values within a column followed by different lowercase letters indicated significant difference atP<0.05.

2.2 40 mg·kg-1 TBBPA對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

微生物硝化、反硝化、厭氧氨氧化是土壤中無(wú)機(jī)氮循環(huán)最重要的轉(zhuǎn)化過(guò)程，這些過(guò)程主要受土壤微生物相關(guān)代謝活動(dòng)的調(diào)控[17]。如2.1節(jié)結(jié)果所示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，只有當(dāng)TBBPA濃度為40 mg·kg-1時(shí)才對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮循環(huán)有顯著影響，因此僅在該濃度下分別針對(duì)好氧和厭氧條件下無(wú)機(jī)氮循環(huán)相關(guān)微生物的豐度進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示?？偟膩?lái)說(shuō)，不同處理?xiàng)l件下的土壤群落結(jié)構(gòu)相似，在所有測(cè)試樣品中，變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)是豐度最高的5大門(mén)類。區(qū)別在于，在40 mg·kg-1TBBPA處理下，無(wú)論好氧還是厭氧條件，變形菌門(mén)的豐度都增大，而綠彎菌門(mén)和放線菌門(mén)的豐度都降低。

表2不同條件下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)門(mén)水平的組成

Table2Taxonomic classification of soil microorganism on different conditions at phylum level %

類別PhylumA-CKA-40AN-CKAN-40酸桿菌門(mén)Acidobacteria19.0317.8012.4115.60放線菌門(mén)Actinobacteria8.726.709.608.04裝甲菌門(mén)Armatimonadetes0.750.310.420.31擬桿菌門(mén)Bacteroidetes4.836.369.6810.54綠彎菌門(mén)Chloroflexi6.873.4713.508.07硬壁菌門(mén)Firmicutes0.911.394.755.03芽單胞菌門(mén)Gemmatimonadetes1.672.001.491.35硝化螺旋菌門(mén)Nitrospirae0.691.050.510.79浮霉菌門(mén)Planctomycetes0.600.450.460.39變形菌門(mén)Proteobacteria29.4141.0129.9635.74其他Others25.2018.3116.1813.03

表3不同條件下土壤硝化細(xì)菌在屬水平的群落組成

Table3Taxonomic classification of soil nitrobacteria on different conditions at genus level %

類別GenusA-CKA-40AN-CKAN-40Sphingomonas1.352.001.560.86Nitrospira0.691.050.510.79Burkholderiales(unclassified)0.400.530.310.37Comamonadaceae(unclassified)0.360.650.450.44Rhodocyclaceae(unclassified)0.330.440.851.52Spartobacteria(unclassified)0.140.060.050.02Ramlibacter0.130.240.200.20Bacillus0.130.120.310.29Spartobacteria_genera_incertae_sedis0.120.080.070.06Methyloversatilis0.100.090.070.02總計(jì)Total3.745.274.384.57

表4不同條件下土壤反硝化細(xì)菌在屬水平的群落組成

Table4Taxonomic classification of soil denitrobacteria on different conditions at genus level %

類別GenusA-controlA-40AN-controlAN-40Chitinophagaceae(unclassified)0.791.27 1.08 0.77Rhodocyclaceae(unclassified)0.33 0.44 2.12 1.52Sphingobacteriales(unclassified)0.31 0.11 0.09 0.08Arthrobacter0.28 0.14 0.28 0.32Flavisolibacter0.27 0.68 0.62 1.09Terrimonas0.19 0.32 0.24 0.20Hyphomicrobium0.17 0.18 0.11 0.21Parasegetibacter0.13 0.18 0.17 0.26Bacillus0.13 0.12 0.31 0.29Methyloversatilis0.10 0.09 0.07 0.02總計(jì)Total2.743.535.094.76

2.3 40 mg·kg-1 TBBPA對(duì)無(wú)機(jī)氮循環(huán)的影響機(jī)制

近年來(lái)，根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果來(lái)推測(cè)微生物功能得到了廣泛應(yīng)用[20]。為了更好地說(shuō)明40 mg·kg-1TBBPA對(duì)無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化途徑的影響，利用PICRUSt軟件預(yù)估了無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化過(guò)程中的基因變化。圖1展示了對(duì)照組(A-CK、AN-CK)和40 mg·kg-1TBBPA處理?xiàng)l件下厭氧和好氧組內(nèi)所有有顯著性差異(P<0.05)的無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化相關(guān)基因。好氧條件下，A-CK和A-40組有6個(gè)氮相關(guān)基因都顯示出了顯著差異。TBBPA暴露使得其中2種功能基因，即亞硝酸鹽還原酶K00368(nirK)和硝酸鹽還原酶K00370(narG)的表達(dá)被誘導(dǎo)，另外4個(gè)基因，即參與硝酸鹽還原的K00360(nasB)、K00371(narH)和K02567(napA)及氧化亞氮還原酶K00376(nosZ)的表達(dá)受到抑制。厭氧條件下，硝酸鹽還原酶K00360(nasB)的表達(dá)同好氧條件下一樣受到抑制，而亞硝氮還原酶K00363(nirD)和一氧化氮還原酶K04561(norB)的表達(dá)則受到誘導(dǎo)。

圖1 好氧(a)和厭氧(b)條件下40 mg·kg-1 TBBPA對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮循環(huán)相關(guān)基因的作用Fig.1 Effect of 40 mg·kg-1 TBBPA on functional genes related to inorganic nitrogen transformation in aerobic (a) or anaerobic (b) conditions

圖2 TBBPA對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮循環(huán)途徑的可能影響Fig.2 Possible effect of TBBPA on soil inorganic nitrogen transformation pathway

3 結(jié)論