榮芮，李婷婷，張玉云，顧穎,，夏寧邵,，李少偉,

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昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在疫苗研究中的應(yīng)用進(jìn)展

榮芮1，李婷婷1，張玉云2，顧穎1,2，夏寧邵1,2，李少偉1,2

1 廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102 2 廈門大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點實驗室，福建 廈門 361102

榮芮, 李婷婷, 張玉云, 等. 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在疫苗研究中的應(yīng)用進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(4): 577–588.Rong R, Li TT, Zhang YY, et al. Progress in vaccine development based on baculovirus expression vector system. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 577–588.

昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) (Baculovirus expression vector system，BEVS)已成功應(yīng)用于多種蛋白的表達(dá)，并為疫苗開發(fā)提供了充足的原材料。相比其他表達(dá)系統(tǒng)，BEVS具有許多優(yōu)勢：桿狀病毒專一寄生于無脊椎動物，安全性高；重組蛋白表達(dá)水平高；可對重組蛋白進(jìn)行正確折疊和翻譯后修飾，獲得具有生物活性的蛋白；適應(yīng)于多基因表達(dá)如病毒樣顆粒 (Virus-like particle) 的復(fù)雜設(shè)計；適用于大規(guī)模無血清培養(yǎng)等。為了更好地理解BEVS在疫苗研究中的應(yīng)用前景，文中將從BEVS的發(fā)展及其在疫苗研究中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

桿狀病毒，昆蟲細(xì)胞，蛋白表達(dá)，疫苗，病毒樣顆粒

昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) (Baculovirus expression vector system，BEVS) 自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)后，現(xiàn)已被廣泛用于外源蛋白表達(dá)、藥物篩選、疫苗開發(fā)、基因治療等領(lǐng)域。BEVS因其安全性高、操作簡便、可用于多亞基蛋白同時表達(dá)、適用于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢，具有極大的發(fā)展前景。文中將從BEVS的系統(tǒng)發(fā)展及其在疫苗開發(fā)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行闡述。

1 桿狀病毒

桿狀病毒 (Baculovirus) 是一類雙鏈、環(huán)狀閉合、基因組大小范圍為80?180 kb的DNA病毒[1]。桿狀病毒的形態(tài)一般為棍棒狀，長度為200?400 nm，寬度為40–110 nm[2]。目前已分離得到了600多種桿狀病毒，完成了近60多種桿狀病毒的全基因組測序工作。根據(jù)國際病毒分類命名委員會第九次報告，桿狀病毒共屬一個科 (Baculoviridae)，共4個屬：甲型 (Alphabaculovirus)、乙型 (Betabaculovirus)、丙型 (Gammabaculovirus) 和丁型桿狀病毒屬 (Deltabaculovirus)，它們分別以核型多角體病毒 (Nuclear polyhedrosis virus，NPV) 或顆粒體病毒 (Granulovirus，GV) 形式感染相應(yīng)宿主[3]。此外，桿狀病毒也可依據(jù)其含有包埋型病毒 (Occlusion- derived virions，ODVs) 的多少，分為3類：核型多角體病毒(含有較多個)、顆粒型病毒(含有一個)與非包埋型病毒(不含有)[4]。

其中，從苜蓿環(huán)紋夜蛾中分離出的苜蓿蠖核型多角體病毒 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV) 是目前研究最為廣泛的桿狀病毒之一，其基因組大小約為130 kb并含有154個開放閱讀框[5]。AcNPV在其感染期內(nèi)會有2種病毒形式：包埋型病毒，介導(dǎo)病毒在不同宿主之間的傳播；芽生病毒 (Budded virions，BVs)，介導(dǎo)病毒在同一宿主中不同部位的擴(kuò)散[6]。BVs中有一種生物學(xué)功能較為突出的囊膜糖蛋白Gp64，它在病毒感染的早期和晚期均有表達(dá)，早期定位于細(xì)胞質(zhì)，隨后遷移至質(zhì)膜。當(dāng)桿狀病毒通過質(zhì)膜出芽時獲得Gp64，缺失此蛋白時，將無法完成細(xì)胞間感染[7]。此外，Gp64糖蛋白也常與外源蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，用于表面展示技術(shù)，為增強蛋白免疫原性、蛋白的結(jié)構(gòu)解析工作提供了有力支撐[8]。AcNPV的基因表達(dá)過程可分為4個階段：立早期、早期、晚期和極晚期，其中多角體蛋白 (Polyhedrin) 和P10 (纖維網(wǎng)絡(luò)相關(guān)) 蛋白會在極晚期大量富集。由于多角體基因(，) 和帶有強啟動子且編碼蛋白為病毒擴(kuò)增的非必要組分，所以可在刪除上述基因的同時插入外源片段，誘導(dǎo)目的蛋白的大量表達(dá)[1]。

2 昆蟲細(xì)胞

桿狀病毒的受體細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞。應(yīng)用較廣的細(xì)胞系主要有2種：草地夜蛾細(xì)胞系 (，)，常用及其分離株細(xì)胞[9]；粉紋夜蛾細(xì)胞系 (，)，常用商品化的High FiveTM(H5) 細(xì)胞[10]。目前根據(jù)對這幾種細(xì)胞系的報道及本實驗室的工作總結(jié)發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞更適合于重組病毒擴(kuò)增及包裝；因細(xì)胞直徑更大，更適用于病毒滴度空斑實驗觀察；H5細(xì)胞更適用于分泌蛋白表達(dá)。新細(xì)胞系的建立更加豐富了BEVS的功能和應(yīng)用，例如由Protein Science Corporation生產(chǎn)并已通過FDA認(rèn)證，成功用于流感疫苗生產(chǎn)的SF+[11]。由于野生型昆蟲細(xì)胞難以對目的蛋白進(jìn)行高甘露糖型糖基化修飾，部分科學(xué)家對宿主細(xì)胞進(jìn)行改造，研發(fā)出可加強其糖基化復(fù)雜程度的TM[12]。此外，還有通過錨蛋白Vankyrin改造技術(shù)延長了細(xì)胞生長周期的細(xì)胞系與可以增加細(xì)胞活性及蛋白表達(dá)量的等眾多細(xì)胞系[13-14]。這些細(xì)胞均具有對AcNPV極度敏感、適應(yīng)貼壁/搖瓶/WAVE生物波浪反應(yīng)器等多種培養(yǎng)方式、適應(yīng)于無血清培養(yǎng)條件和便于大規(guī)模生產(chǎn)等特點。

3 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)

昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是以桿狀病毒作為外源基因載體，以昆蟲細(xì)胞作為宿主進(jìn)行基因組自我擴(kuò)增與目的蛋白的表達(dá)。昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體需要質(zhì)粒載體和野生型桿狀病毒整合成含有外源基因的重組桿狀病毒才能實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。構(gòu)建重組桿狀病毒的關(guān)鍵在于構(gòu)建穿梭轉(zhuǎn)移載體：將目的基因插入到或啟動子下游的多克隆位點，因轉(zhuǎn)移載體中含有與野生型桿狀病毒進(jìn)行重組的同源序列，所以轉(zhuǎn)移載體與親本病毒DNA進(jìn)行重組時將獲得攜帶有外源基因的重組病毒。根據(jù)重組發(fā)生在昆蟲細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，構(gòu)建重組桿狀病毒可分為細(xì)胞內(nèi)重組和細(xì)胞外重組兩種方式。

3.1 重組病毒的胞內(nèi)重組

細(xì)胞內(nèi)重組方式即使用轉(zhuǎn)移載體和親本桿狀病毒共感染昆蟲細(xì)胞，使外源序列通過與親本桿狀病毒基因組之間的同源序列發(fā)生重組，從而得到重組病毒。早期重組一般采用野生型桿狀病毒，重組率極低。后期利用基因工程手段可在桿狀病毒基因組ORF603與ORF1629中加入多個36Ⅰ酶切位點，從而得到去除了某些復(fù)制必需片段的線性親本桿狀病毒，使感染細(xì)胞后含有目的片段的重組桿狀病毒的比例高達(dá)約90%[15]，BaculoGoldTM即采用這種方式。后續(xù)部分商業(yè)化試劑盒如BacMagicTM與BACTM又將必需片段ORF1629刪除，并用細(xì)菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome，BAC) 取代結(jié)構(gòu)基因，改造后的環(huán)狀桿狀病毒能在大腸桿菌中復(fù)制卻不能在昆蟲細(xì)胞中正常傳代。當(dāng)其與攜帶有目的基因的轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移載體上的外源基因就會組裝到啟動子的下游，移除BAC并恢復(fù)ORF1629的基因功能。采用這種方法構(gòu)建的重組桿狀病毒質(zhì)粒具有穩(wěn)定性良好、儲存時間較長并保持感染昆蟲細(xì)胞的能力等優(yōu)勢[16]。

3.2 重組病毒的胞外重組

通過胞外重組的方式得到含有目的片段的重組桿狀病毒可大大提高重組桿狀病毒的準(zhǔn)確率。經(jīng)典的Bac-to-Bac系統(tǒng)通過穿梭質(zhì)粒 (pFastBacTM)、輔助質(zhì)粒 (Helper) 與桿粒 (Bacmid) 可在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)座重組，將目的基因?qū)霔U狀病毒基因組中，隨后再通過藍(lán)白斑篩選技術(shù)得到正確的重組桿狀病毒，便可直接進(jìn)行后續(xù)的病毒轉(zhuǎn)染實驗[6, 17]。此外，Patel等也構(gòu)建了酵母-昆蟲細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體，他們將啤酒酵母的自主復(fù)制序列 (Autonomously replicating sequence，ARS) 和著絲點功能相關(guān)序列 (Centromeric sequence，CEN) 引入桿狀病毒基因組的結(jié)構(gòu)基因中，使桿狀病毒能夠在酵母體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，并能夠和相應(yīng)的轉(zhuǎn)移載體發(fā)生重組。這種載體的構(gòu)建方法最快可以在10 d內(nèi)得到重組病毒，避免了繁瑣的空斑篩選，另外，此方法還能同時分離多個不同的重組子，所以是一個快速而高效的桿狀病毒表達(dá)載體篩選系統(tǒng)，但這種構(gòu)建方法的缺點是需要利用蔗糖密度梯度超速離心技術(shù)來確?；蚪M的穩(wěn)定性[18]。

3.3 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的優(yōu)化

近年來，為提高分泌蛋白的表達(dá)量，研究人員陸續(xù)開始探索新的技術(shù)和應(yīng)用。例如在桿狀病毒基因組中敲除和基因，它們的缺失會增加分泌及膜靶向蛋白的產(chǎn)生，同時可顯著延長宿主細(xì)胞的存活期[19-20]，BestBacTM、BacMagicTM、BACTM等商品化BEVS均采用此技術(shù)。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，敲除基因后的重組桿狀病毒對流感病毒的血球凝集素蛋白 (Hemagglutinin，HA) 和人類獲得性免疫缺陷病毒包膜糖蛋白Gp140的分泌表達(dá)具有明顯提升作用。此外，有科學(xué)家利用病毒錨蛋白 (Viral ankyrin/Vankyrin) 共表達(dá)技術(shù)與可持續(xù)表達(dá)錨蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)情況監(jiān)測，研究結(jié)果表明此技術(shù)能有效調(diào)控病毒感染后的細(xì)胞凋亡過程，外源蛋白的表達(dá)周期可延長至6 d，同時目的蛋白的產(chǎn)量顯著增加，相關(guān)載體pAcVE.02/03及細(xì)胞系均已商品化[13]。針對種類多樣的BEVS，部分研究學(xué)者研發(fā)出了MultiBacTM與biGBacTM表達(dá)體系，它們均可通過多基因片段串聯(lián)技術(shù)表達(dá)攜帶有多個亞基的蛋白復(fù)合體，這為解析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及相關(guān)生物學(xué)功能研究提供了很大支持[21-23]。2016年，Martínez-Solís等通過研究啟動子相關(guān)功能，發(fā)現(xiàn)當(dāng)啟動子與啟動子連用或?qū)幼印幼优c第五同源區(qū)段 (Homologous region 5，hr5) 串聯(lián)使用時，會使目的蛋白的表達(dá)量大幅提升[24-25]。2018年，Zhang等向AcNPV相關(guān)載體中插入了一段可靶向凋亡蛋白酶1 (Caspase 1) 的短發(fā)卡型RNA (Short-hairpin RNA)，抑制了細(xì)胞凋亡，外源蛋白表達(dá)量明顯增加[26]。目前，應(yīng)用較為廣泛的商品化BEVS的相關(guān)信息見表1。

3.4 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的獨特優(yōu)勢

相比大腸桿菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)，昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)具有以下獨特優(yōu)勢：1) 桿狀病毒具有較高的種屬特異性，專一寄生于無脊椎動物，安全性高；2) 昆蟲細(xì)胞可對外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾作用 (如糖基化、磷酸化、乙酰化等)[31]；3) 桿狀病毒基因組中的/基因具有強啟動子，可用于完成外源蛋白的高效轉(zhuǎn)錄；4) 桿狀病毒基因組可容納大片段外源基因，據(jù)目前報道最高可容納25個外源cDNA，具有較好的可塑性[22]，多啟動子技術(shù)也使得BEVS可以同時表達(dá)多個蛋白，非常適合于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗原如病毒樣顆粒(Virus-like particle，VLP) 的構(gòu)建[32-33]，相比大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)，BEVS的顆粒組裝效率更高；5) 相較哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，BEVS在動物病毒VLP研究中應(yīng)用更為廣泛，由其生產(chǎn)的疫苗在醫(yī)藥審批程序上有望通過綠色通道獲得更快的審批途徑。

表1 代表性商品化昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)匯總

4 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與疫苗研制

自1983年Smith等首次利用BEVS成功表達(dá)純化出人β-干擾素后，BEVS在近30多年來已被進(jìn)一步優(yōu)化，廣泛用于實驗室研究及商業(yè)化生產(chǎn)，例如葛蘭素史克公司 (GlaxoSmithKline，GSK) 基于BEVS生產(chǎn)的人乳頭狀瘤病毒疫苗Cervarix?[34]和Protein Sciences Corporation生產(chǎn)的流感疫苗FluBlok?[35]。其中，VLP是一類不含基因組或不具感染性的蛋白多聚物，VLP和真病毒顆粒的構(gòu)象與組成成分高度相似并可將抗原表位最大程度地展示在其表面。因VLP不含有病原體的遺傳物質(zhì)，所以其安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于滅活或減毒疫苗，這使VLP在疫苗研究中更具優(yōu)勢，BEVS因其具有的獨特優(yōu)勢在VLP疫苗研究和生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用前景。

4.1 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與商品化疫苗

至今為止，利用BEVS生產(chǎn)并已成功上市的疫苗有7種，詳細(xì)信息見表2。其中由GSK公司研制的疫苗Cervarix?是利用BEVS生產(chǎn)VLP疫苗的成功代表，Cervarix?為二價苗，主要預(yù)防HPV16、18兩個型別，它是利用BEVS共表達(dá)HPV16、18型別的結(jié)構(gòu)蛋白L1 (L1蛋白為HPV顆粒表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白)，再經(jīng)自組裝形成具備免疫原性但喪失感染能力的VLP。一系列臨床試驗也證實了Cervarix?的安全性、保護(hù)效果(除HPV16與18型別，還可對HPV31、33、53與58型別具有一定程度的交叉保護(hù)效果)、持久性(有效保護(hù)時間≥6.4年) 等[36-39]。與其他HPV預(yù)防性疫苗Gardasil?(四價，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng))、GARDASIL?(九價，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)) 與正處于臨床Ⅲ期的馨可寧(二價，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)) 相比，Cervarix?具有以下獨特優(yōu)勢：1) 針對HPV16、18型別，Cervarix?在不同年齡受試組中可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生遠(yuǎn)高于Gardasil?免疫組的抗血清滴度，同時也能誘導(dǎo)機(jī)體生成更多的效應(yīng)T細(xì)胞與記憶B細(xì)胞[40]；2) 相較生產(chǎn)成本低、周期短的大腸桿菌來源的馨可寧，Cervarix?幾乎不含有內(nèi)毒素，產(chǎn)品穩(wěn)定性更好，批間差更小。

利用BEVS生產(chǎn)亞單位疫苗的成功代表有FluBolk?。針對流感病毒，市面上的滅活、減毒疫苗存在著一些不足之處：利用雞胚細(xì)胞大規(guī)模制備疫苗原材料耗時長；成品疫苗中可能存在致病毒株的逃逸突變、含有化學(xué)劑福爾馬林與致敏原雞卵清白蛋白的潛在危害等[41]。FluBlok?于2013年由美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，用以預(yù)防流感病毒的大面積爆發(fā)。它是由Protein Sciences Corporation利用BEVS研制并已成功上市的世界上第一支針對流感病毒的三價重組疫苗 (Recombination HA vaccine，rHA vaccine)，其免疫原由3種不同流感病毒株的HA等量組合而成(3種病毒株分別來自甲型流感病毒中的H1、H3亞型與乙型流感病毒中的Y/V亞系)。臨床試驗顯示相比同劑量的三價滅活疫苗(Trivalent inactivated vaccine，TIV)，rHA vaccine能保證在無明顯毒副作用的前提下誘導(dǎo)機(jī)體生成更高滴度的抗血清，同時也能更為有效地刺激機(jī)體進(jìn)行相關(guān)免疫應(yīng)答[11,42-44]。2016年，F(xiàn)DA又通過了Flubolk?四價流感疫苗，同時覆蓋了突發(fā)率較高的H1、H3亞型與Y/V亞系。

除人用疫苗外，BEVS在獸用疫苗領(lǐng)域也作出了較大貢獻(xiàn)，針對豬瘟病與二型豬圓環(huán)病毒，已有5種成功上市的預(yù)防性疫苗，它們的出現(xiàn)極大程度上緩解了畜牧業(yè)的生產(chǎn)成本及養(yǎng)殖風(fēng)險。前期，歐洲藥品管理局針對Porcilis?Pesti與BAYOVAC CSF E2?指導(dǎo)了一系列臨床評估實驗，結(jié)果表明接種過其中任意一種疫苗的小豬均能有效防止豬瘟病毒在體內(nèi)的繁殖，相比對照組，實驗組的小豬生長狀態(tài)均良好[45-46]。B. Ingelheim與Merck Animal Health針對二型豬圓環(huán)病毒所生產(chǎn)的預(yù)防性疫苗均為亞單位疫苗，CircoFLEX?、Cirumvent?PCV與Porcilis?PCV都適用于三周齡以上的小豬，針對剛出生的小豬 (≥3 d)，可使用Cirumvent?PCV對其進(jìn)行1 mL劑量的雙針免疫策略。

4.2 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與臨床研究階段疫苗

除了已被批準(zhǔn)上市的數(shù)種疫苗，還有很多利用BEVS生產(chǎn)的疫苗候選物正處于臨床試驗階段，詳細(xì)信息見表3。

Ⅰ型糖尿病為一種較為常見的自身免疫疾病，其中谷氨酸脫羧酶 (Glutamic acid decarboxylase，GAD65) 為主要的在研靶標(biāo)[52]。2005年，Diamyd公司以人GAD65與氫氧化鋁聯(lián)合使用的方式對治療成年型糖尿病開展了長達(dá)5年的試驗追蹤，結(jié)果表明由BEVS生產(chǎn)的GAD65具有很好的安全性并能有效緩解人體內(nèi)C肽的釋放[53]。2017年，Beam等通過貝葉斯分析法對145位受試者進(jìn)行了數(shù)據(jù)采集及分析，證實了此疫苗候選物確實能夠有效減緩受試者體內(nèi)C肽的下降速率[52]。

表2 由BEVS生產(chǎn)的已上市疫苗

表3 基于BEVS生產(chǎn)的處于臨床試驗的人用疫苗候選物

諾瓦克病毒 (Norwalk virus) 能誘發(fā)急性腸胃炎、全身肌肉痛等不良癥狀，對公民健康造成了嚴(yán)重威脅。Ligocyte公司與Baylor College of Medicine醫(yī)療中心利用BEVS生成了Norwalk virus VLP并分別開展了相關(guān)臨床試驗，試驗結(jié)果表明Norwalk virus VLP具有較好安全性并能有效預(yù)防部分病毒的入侵[54-55]。

呼吸道合胞病毒 (Respiratory syncytial virus，RSV) 是誘發(fā)一系列呼吸道疾病的主要病原體之一，相關(guān)病例在小孩及老年人中較為常見。2012年，Novavax公司利用BEVS表達(dá)出RSV外殼表面的Fusion糖蛋白，后續(xù)將其加工成直徑約為40 nm的蛋白顆粒疫苗候選物并在棉鼠動物模型上證實了此疫苗能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生IgG型中和抗體，此外還能有效抑制RSV在肺部的擴(kuò)增[56]。隨后，Novavax對其安全性及免疫原性開展了Ⅰ期臨床試驗，相關(guān)結(jié)果表明受試者接種RSV F蛋白顆粒疫苗候選物后無明顯不良癥狀，并且最快可在7 d后檢測到相關(guān)免疫應(yīng)答[57]。

4.3 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與臨床前疫苗

4.3.1 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在臨床前亞單位疫苗中的研究

昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于流感疫苗的生產(chǎn)研究，體系較為成熟，該系統(tǒng)對不同型別的基于HA的疫苗候選物均有較好的表達(dá)水平。大部分流感亞單位疫苗已處于臨床研究階段。近期針對禽流感病毒H6N1，Hsieh等報道了利用雙順反子昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)開展的相關(guān)研究。他們通過使用pFastBacTM載體與細(xì)胞獲得了可進(jìn)行H6N1毒株HA1分泌表達(dá)的重組桿狀病毒，后續(xù)的動物實驗也表明此新型亞單位疫苗相較雞胚細(xì)胞來源的減毒病毒疫苗能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)生成更高滴度的抗血清[62]。這些前瞻性研究為緩解相關(guān)行業(yè)的生產(chǎn)壓力，打開相應(yīng)疫苗市場作出了貢獻(xiàn)。

4.3.2 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在臨床前VLP疫苗中的研究

輪狀病毒 (Rotavirus) 是造成嬰幼兒患嚴(yán)重腹瀉病的主要病原體，全球每年因感染輪狀病毒而死的兒童大約有60萬，其中80%均發(fā)生在條件落后的國家[63]。目前，已納入國家免疫計劃的輪狀病毒疫苗有單價苗Rotarix?(GSK公司生產(chǎn)) 和五價苗Rotateq?(MSD公司生產(chǎn))，均為減毒人用疫苗[64]。此外也有針對輪狀病毒外衣殼表面主要的中和抗原VP4、VP7及其他次要抗原(VP3、 VP6與VP1等) 設(shè)計VLP用以篩選疫苗候選物的相關(guān)文獻(xiàn)報道。Crawford等利用BEVS表達(dá)了VP2/6/7與VP2/4/6/7這兩種VLP，實驗結(jié)果表明它們在顆粒形態(tài)與中和能力上都和野生型輪狀病毒相似，這為后續(xù)闡明輪狀病毒入胞機(jī)制和研發(fā)輪狀病毒治療性疫苗提供了堅實基礎(chǔ)[65]。

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV) 為黃病毒科中的黃病毒屬，輕微感染ZIKV時可誘發(fā)發(fā)熱、斑狀丘疹等癥狀，嚴(yán)重時會損害成人神經(jīng)系統(tǒng)或通過母嬰傳播造成新生兒小頭并發(fā)癥等嚴(yán)重后果。目前針對ZIKV的疫苗候選物正在積極研制中，暫無可用疫苗[66-67]。2018年Dai等報道通過Bac-to-Bac系統(tǒng)共表達(dá)膜前體蛋白PrM/M與包膜蛋白E，構(gòu)建了ZIKV VLP。實驗結(jié)果顯示ZIKV VLP的免疫原性雖然略低于滅活的ZIKV，但也仍能刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強的Th1與Th2類免疫反應(yīng)，激發(fā)小鼠體內(nèi)的T細(xì)胞大量富集，這對病毒的清除是至關(guān)重要的。此外，ZIKV VLP可刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的IgG型中和抗體，這也為后續(xù)的疫苗研發(fā)提供了新的研究思路[68]。

手足口病是一種在幼童中較為常見并具有高致病性的傳染性疾病，主要由腸道病毒71 (Enterovirus 71，EV71) 與科薩克病毒(Coxsackieviruses) A16、A6和A10引起。最近，Zhang等利用BEVS構(gòu)建了EV71/CVA6/CVA10/CVA16四價VLP疫苗候選物并針對其免疫原性、交叉保護(hù)效果與持久性等方面開展了相關(guān)實驗。實驗結(jié)果表明四價VLP疫苗候選物相較單價VLP疫苗能刺激小鼠體內(nèi)型特異性的長時間免疫應(yīng)答，當(dāng)小鼠被動免疫此疫苗時，能有效預(yù)防單種或多種病毒混合物的入侵[69]。

4.4 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表面展示技術(shù)在疫苗中的應(yīng)用

BEVS表面展示技術(shù)一般通過目的蛋白與病毒衣殼蛋白Gp64融合表達(dá)的方式將外源蛋白成功展示在病毒表面，此技術(shù)具有可指定展示部分功能性表位、增強蛋白免疫原性等優(yōu)點，并為藥物高通量篩選、臨床診斷治療、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域提供了便利。Yoshida等針對瘧疾構(gòu)建了AcNPV- CSPsurf重組桿狀病毒，成功將伯氏瘧原蟲的環(huán)子孢子蛋白與桿狀病毒外殼上的Gp64融合表達(dá)[70]。此外，BEVS表面展示技術(shù)在流感病毒、腸道病毒等相關(guān)領(lǐng)域也有不少發(fā)現(xiàn)，為相關(guān)疫苗候選物的開發(fā)工作提供了更多選擇[71-73]。2017年，Lee等利用Bac-to-Bac系統(tǒng)獲得了Bac-RSVM2重組桿狀病毒，從而誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)生成了大量CD8+T細(xì)胞[74]。2016年，Sim等利用BEVS構(gòu)建了rBac-HA重組桿狀病毒，相關(guān)動物實驗已證實rBac-HA能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答并對其他亞型的流感病毒具有廣譜保護(hù)效果[75]。

5 結(jié)語

經(jīng)過近40年的發(fā)展，昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) (BEVS) 已成為外源重組蛋白表達(dá)的有力工具。目前較為前沿的研究中，基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)對VLP或亞單位疫苗進(jìn)行設(shè)計，再利用BEVS進(jìn)行抗原制備及相關(guān)研究已逐見報道。載體設(shè)計的優(yōu)化、部分基因的敲除/敲入與重組病毒分離技術(shù)的簡化均加快了疫苗前期的開發(fā)流程，此外，闡明桿狀病毒如何利用宿主細(xì)胞進(jìn)行自身復(fù)制的機(jī)制、促進(jìn)重組桿狀病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)更為高效地進(jìn)行目的蛋白的自折疊及糖側(cè)鏈的加工修飾依舊是擴(kuò)大BEVS應(yīng)用前景的關(guān)鍵之處。隨著分子生物學(xué)技術(shù)手段的快速進(jìn)步與醫(yī)藥行業(yè)的蓬勃發(fā)展，期望BEVS能借助其獨特優(yōu)勢在蛋白制備、疫苗研發(fā)、蛋白結(jié)構(gòu)解析及藥物設(shè)計等方面為人類健康作出更多貢獻(xiàn)。

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Progress in vaccine development based on baculovirus expression vector system

Rui Rong1, Tingting Li1, Yuyun Zhang2, Ying Gu1, 2, Ningshao Xia1, 2, and Shaowei Li1, 2

1 National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Disease, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China 2 State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics,School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China

Baculovirus expression vector system (BEVS) has been successfully applied to the over-expression of various proteins, thus providing sufficient materials for vaccine research. Compared to other systems, BEVS has many advantages: baculovirus solely being parasitic in invertebrates, the resultant products conferring high safety to mammalian, high expression level of recombinant proteins, preferable folding for eukaryotic protein, proper post-translational modification required for biological function, suitable for multiple genes co-expression and large-scale production with serum-free culture media. To better understand the advantages and prospective of BEVS for the vaccine research, this article will review the development of BEVS and its application on vaccine research.

baculovirus, insect cell, protein expression, vaccine, virus-like particles

10.13345/j.cjb.180301

July 18, 2018;

October 15, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. U1705283, 31670935, 81701637).

Shaowei Li. Tel: +86-592-2880620; E-mail: shaowei@xmu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. U1705283，31670935，81701637) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)