邱楓饒 金鵬 蔡益婷

【摘要】 目的：探討促排卵方案及小鼠體外受精環(huán)節(jié)中去除顆粒細(xì)胞、精液洗滌、精卵共孵育時(shí)間對昆明小鼠體外受精的影響，為人類輔助生殖技術(shù)提供理論基礎(chǔ)，并為新開展的輔助生殖實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控提供更直接可靠的方法。方法：（1）對昆明小鼠促排卵，促排藥物孕馬血清（PMSG）+絨毛膜促性腺激素（HCG）分為三個(gè)組合，分別為6 IU+6 IU，8 IU+8 IU，10 IU+10 IU，統(tǒng)計(jì)并比較三組獲得的卵子數(shù)。（2）分別用卵丘復(fù)合體和去除卵丘的卵母細(xì)胞與小鼠精子進(jìn)行體外受精，比較兩組受精率。（3）用上游法和簡單洗滌法處理小鼠精子，進(jìn)行體外受精，比較兩組受精率。（4）精卵共孵育4 h和16 h，比較兩組受精率。結(jié)果：（1）促排藥物PMSG+HCG為8 IU+8 IU時(shí)獲得卵子數(shù)量顯著高于其他兩組（P<0.05）。（2）卵丘復(fù)合體和去除卵丘的卵母細(xì)胞相比，受精率顯著增高（P<0.05）。（3）簡單洗滌法洗滌精子后與卵子受精比上游法處理精子受精率高（P<0.05）。（4）精卵共孵育4 h的受精率高于共孵育16 h受精率（P<0.05）。結(jié)論：選擇合適的促排卵藥物組合PMSG 8 IU和 HCG 8 IU可以獲得最多數(shù)量的卵子，減少小鼠資源的浪費(fèi)，體外受精時(shí)去除卵丘復(fù)合體的卵丘細(xì)胞導(dǎo)致受精率顯著下降，洗滌法處理精液較上游法明顯提高受精率，短時(shí)受精能減少氧化應(yīng)激對受精過程的影響，較隔夜受精受精率高。

【關(guān)鍵詞】 昆明小鼠 促排卵 體外受精

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.32.076 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）32-0-03

[Abstract] Objective： To explore the effects of controlled ovarian hyperstimulation，granulosa cells removal， semen washing and the time of incubation for sperm and egg on the outcome in vitro fertilization of Kunming mice， provide theoretical basis for human assisted reproductive technology and provide a basis for the establishment of the new assisted reproductive laboratory. Method： （1） Different dosage of HMG and HCG were carried out to stimulate Kunming mice ovulation， doses were divided into three groups 6 IU+6 IU， 8 IU+8 IU， 10 IU+10 IU， then the quantity of oocyte in each group were compared to determine the best combination dose. （2） Oocyte-corona-cumulus complexes and M Ⅱ oocytes removed of cumulus cells were respectively used in vitro fertilization， then compared their fertility rates. （3） Mouse sperm were treated by upstream and washing methods， then compared their fertility rates. （4） The time of in vitro fertilization were respectively four hours and sixteen hours， then compared their fertility rates. Result： （1） The biggest amount and the best quality of oocytes when HMG and HCG were 8 IU+

8 IU （P<0.05）. （2） The fertility rate of oocyte-corona-cumulus complex was higher than M Ⅱ oocytes removed of cumulus cells （P<0.05）. （3） The fertility rate of sperm treated by upstream was higher than washing methods （P<0.05）. （4） The fertility rate of incubation for four hours was higher than sixteen hours （P<0.05）.

Conclusion： The most oocytes by selecting the appropriate combination of ovulation stimulating drugs （PMSG 8 IU+HCG 8 IU）， then the waste of resources in mice can be reduced. The removal of cumulus cells during in vitro fertilization can cause fertility rate significantly decreased， sperm treated by washing method upstream can develop the fertility rate than treated by upstream， short time fertilization can reduce the effects of oxidative stress on fertilization and the fertility rate is higher than overnight fertilization， so the appropriate fertilization methods and conditions should be chosen to improve the in vitro fertilization rate of mice.

[Key word] Kunming mice Controlled ovarian hyperstimulation Vitro fertilization

First-authors address： The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310052， China

鼠胚實(shí)驗(yàn)（mouse embryo assay，MEA）是目前最常用于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)液、耗材和設(shè)備質(zhì)量控制的生物方法，適用于新建或新啟動(dòng)周期常規(guī)體外受精（IVF）實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制[1]，幫助實(shí)驗(yàn)室人員熟練掌握胚胎操作技術(shù)，并為人類輔助生殖技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。但由于實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)較多，小鼠體外受精實(shí)驗(yàn)體系尚缺乏穩(wěn)定性。有研究表明，大劑量的PMSG影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量[2]，不同劑量激素組合促排卵得出的卵子數(shù)目和質(zhì)量也有很大差別[3]。另外卵丘細(xì)胞的去除、精液的處理方法、受精時(shí)間長短等因素對小鼠體外受精均有不同的影響[4-6]。雖然已有小鼠促排卵及體外受精技術(shù)的報(bào)道，但小鼠品系不同，促排卵劑量及體外受精方法亦有差別。因此本研究對昆明系小鼠促排卵方案進(jìn)行比較，得出最佳促排方案，減少小鼠資源浪費(fèi)，降低實(shí)驗(yàn)成本，對體外受精中卵母細(xì)胞的選擇、精液的處理方法和受精時(shí)間進(jìn)行研究，提高受精率，得出最適合昆明小鼠的受精方式，為新建實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級昆明小白鼠，雌鼠6周齡，體質(zhì)量25～30 g，雄鼠10周齡，體質(zhì)量30～35 g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號：SYXK（浙）2013-0184]。

1.1.2 藥物與試劑 孕馬血清（PMSG）與絨毛膜促性腺激素（HCG）均購自寧波第二激素廠;透明質(zhì)酸酶（hyaluronidas）、HTF、G-IVF，購自Vitrolife公司;人血清白蛋白（HSA）及石蠟油購自SAGE公司。除透明質(zhì)酸酶取卵當(dāng)天配置外，其余培養(yǎng)液均于前1天配置置于37 ℃，6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

1.1.3 耗材與設(shè)備 四孔板購自NUNC公司;1 ml注射器購自龍德醫(yī)用器械有限公司;35 mm培養(yǎng)皿、60 mm培養(yǎng)皿、移液管及玻璃巴氏德管購自BD Falcon公司。另外設(shè)備有丹麥IVFTECH超凈工作臺，日本OLYMPUS解剖顯微鏡，美國THEMRO培養(yǎng)箱，德國Eppendof離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠超排卵劑量的選擇 雌鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，第一組注射PMSG 6 IU和HCG 6 IU，第二組注射PMSG 8 IU和HCG 8 IU，第三組注射PMSG 10 IU和HCG 10 IU。具體實(shí)驗(yàn)方法：第1天下午15：00每只雌鼠腹腔內(nèi)注射PMSG，50 h后腹腔內(nèi)注射HCG，注射HCG后15 h，即第2天早上8：00采用頸椎脫臼法處死雌鼠，在無菌環(huán)境下取出輸卵管，放入預(yù)先平衡好的盛有卵-胚胎緩沖液的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用1 ml注射器刺破輸卵管膨大部，收集卵丘復(fù)合體，放在配置好的透明質(zhì)酸酶中消化時(shí)間小于1 min，洗滌后觀察卵子形態(tài)及計(jì)數(shù)MⅡ期卵子。

1.2.2 精液處理方法的選擇 用頸椎脫臼法處死雄鼠，取雄鼠附睪和輸精管置于裝有預(yù)熱平衡過的1 ml HTF中，擠出輸精管中精子，用針刺破附睪尾（精子活力>50%），收集精子，混勻后平均分配兩組，一組用上游法處理，置于37 ℃，6%CO2培養(yǎng)箱中傾斜45°獲能培養(yǎng)0.5 h，一組用簡單洗滌法處理，在試管中加入提前平衡預(yù)熱的HTF洗液，300 g離心10 min。雌鼠注射PMSG 8 IU和HCG 8 IU，按1.2.1方法超排卵并取出卵丘復(fù)合體，隨機(jī)分為兩組，取以上兩組精子分別加入含有卵子的G-IVF培養(yǎng)液中，調(diào)精子終密度2×106/ml，置于37 ℃，6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，4 h后用G-IVF培養(yǎng)基清洗三次后轉(zhuǎn)移到新的平衡過的G-IVF培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后在倒置顯微鏡下觀察兩細(xì)胞形成情況，計(jì)算受精率。

1.2.3 體外受精卵子的選擇 注射PMSG 8 IU和HCG 8 IU，按照1.2.1方法超排并取出卵丘復(fù)合體，取出后分為兩組，一組為不做處理的卵丘復(fù)合體，一組用透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞。按照1.2.2方法用頸椎脫臼法處死雄鼠，密度梯度離心法處理精液，精子加入兩組含卵子G-IVF培養(yǎng)基中，調(diào)精子終密度2×106/ml，置于37 ℃，6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，用G-IVF培養(yǎng)基清洗三次后轉(zhuǎn)移到新的平衡過的G-IVF培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后在倒置顯微鏡下觀察兩細(xì)胞形成情況，計(jì)算受精率。

1.2.4 授精時(shí)間選擇 注射PMSG 8 IU和HCG 8 IU，按1.2.1方法超排卵并取出卵丘復(fù)合體，按1.2.2方法用頸椎脫臼法處死雄鼠，密度梯度離心法處理精液后體外受精分為兩組，一組置于37 ℃，6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，用G-IVF培養(yǎng)基清洗三次后轉(zhuǎn)移到新的平衡過的G-IVF培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，另一組置于37 ℃，6%CO2培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)16 h，在倒置顯微鏡下觀察兩組兩細(xì)胞形成情況，計(jì)算受精率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以 （x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠超排劑量選擇結(jié)果

注射不同劑量PMSG和HCG得到不同數(shù)目的卵子，PMSG 8 IU和HCG 8 IU時(shí)MⅡ卵子數(shù)目最多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 精液處理方法選擇的結(jié)果

小鼠精液用上游法和簡單洗滌法處理后，簡單洗滌法受精率高于上游法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 體外受精卵子的選擇結(jié)果

用卵丘復(fù)合體和去除卵丘細(xì)胞的卵子受精，用卵冠丘復(fù)合體受精比拆除卵丘細(xì)胞的卵子受精率顯著高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2. 4 受精時(shí)間選擇的結(jié)果

精卵共培養(yǎng)4 h換取新的培養(yǎng)液和精卵過夜培養(yǎng)16 h比較，精卵共培養(yǎng)4 h受精率高于受精16 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3 討論

小鼠超排卵是體外受精-胚胎移植非常重要的一步，為小鼠體外受精-胚胎移植模型的建立提供了基礎(chǔ)。雌鼠超排卵效果受年齡體重、激素劑量、注射時(shí)間及小鼠品系的影響。不同品系小鼠使用超排藥物的有效劑量不同，對于大部分品系推薦5 IU[6]，但有些品系小鼠2.5 IU或高達(dá)10 IU效果可能更好，昆明系鼠作為我國最常使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其卵母細(xì)胞可為新建輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控的重要實(shí)驗(yàn)材料，關(guān)于昆明系鼠促排最佳有效劑量雖有報(bào)道[7]，但所用激素不同最佳劑量亦有不同，本實(shí)驗(yàn)使用6周齡昆明小鼠用PMSG和HCG進(jìn)行促排，選取獲卵數(shù)最多且卵母細(xì)胞質(zhì)量最好的一組為最佳劑量組合，通過比較獲卵數(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著劑量的升高獲卵數(shù)升高，但當(dāng)PNSG和HCG達(dá)到10 IU時(shí)，獲卵數(shù)呈下降趨勢，且卵母細(xì)胞質(zhì)量有所下降，部分卵母細(xì)胞退化，有研究發(fā)現(xiàn)，超排卵可使小鼠卵母細(xì)胞染色體異常的比例增高[8]，推測PMSG和HCG 10 IU可能劑量過大，選取8 IU為本組的最佳劑量組合。

影響小鼠體外受精的因素有很多，雄鼠精子活力為其中很重要的一個(gè)因素，采用上游法和簡單洗滌法均能提高體外受精的受精率，對于人類精子的處理，有人認(rèn)為，洗滌法較上游法得到的精子密度及回收率要明顯增高[9]，也有人認(rèn)為，上游法較簡單洗滌法在妊娠率、流產(chǎn)率、精子密度、精子活力上差異均無顯著性意義[10]。也有認(rèn)為，上游法處理后精子活力（PR）及活率（PR+NP）均要顯著高于簡單洗滌法[11]。而對于小鼠，本實(shí)驗(yàn)采用10周齡雄鼠分別用上游法和簡單洗滌法對小鼠精液處理，結(jié)果顯示簡單洗滌法的精子受精率更高，提示洗滌法比上游法能更好地去除死精，篩選出活力好的精子。有研究去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞存在受精障礙，且不同品系的小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同[12]，本實(shí)驗(yàn)分別用卵丘復(fù)合體和去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞體外受精，卵丘復(fù)合體受精率顯著高于去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，原因可能是卵母細(xì)胞經(jīng)過透明質(zhì)酸酶處理后透明帶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。故為提高小鼠體外受精的受精率，更快更效率地為新建立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行室質(zhì)控，筆者選取卵丘復(fù)合體進(jìn)行體外受精。對于人類的體外受精，短時(shí)受精和隔夜受精兩種方式文獻(xiàn)報(bào)道不一[13]，多數(shù)文獻(xiàn)更傾向于短時(shí)受精更有優(yōu)勢，本實(shí)驗(yàn)比較了小鼠短時(shí)受精和隔夜受精的受精率，結(jié)果顯示短時(shí)受精的受精率顯著高于隔夜受精，這一結(jié)果提示長時(shí)間的共培養(yǎng)導(dǎo)致更多氧化應(yīng)激產(chǎn)物的釋放及高濃度的精子代謝物對受精及胚胎發(fā)育可能都是不利的。

綜上所述，促排劑量過多或過少對促排的卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量都有影響，選取PMSG和HCG 8 IU為最佳劑量組合，可以使獲卵數(shù)達(dá)到最大，減少小鼠資源的浪費(fèi)。采用洗滌法法處理小鼠精液，卵丘復(fù)合體進(jìn)行體外受精，受精時(shí)間選取4 h，提高小鼠受精率，以到達(dá)最高的受精率。

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（收稿日期：2019-09-19） （本文編輯：何玉勤）