敲減CDKL5對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響

張?bào)@宇， 丁 婧， 鄭永慧， 初婷婷， 趙琳琳， 楊濱瑞， 高 騰

X染色體連鎖基因CDKL5(cyclin-dependent kinase-like 5，周期蛋白依賴型激酶樣5)基因編碼一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶，故又名STK9(serine-threonine kinase 9)。CDKL5的基因突變可導(dǎo)致Rett綜合征等神經(jīng)類疾病，因此目前的研究重點(diǎn)聚焦于CDKL5在神經(jīng)元中的功能以及與雷特綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)聯(lián)上[1]，但CDKL5基因在膠質(zhì)瘤[2]、胃癌[3]、卵巢癌[4]、黑素瘤[5]和結(jié)腸癌[6]中有錯(cuò)義突變和同義突變。CDKL5是白血病抗原之一，經(jīng)常在成人T淋巴細(xì)胞白血病中高表達(dá)，可作為腫瘤免疫治療的靶標(biāo)[7]。目前，對(duì)于CDKL5的功能性研究較少，CDKL5的表達(dá)隨神經(jīng)瘤細(xì)胞的分化而不斷上調(diào)，本研究主要敲除人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87中的CDKL5，發(fā)現(xiàn)敲減后顯著抑制U87的細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期發(fā)生停滯，這可以為之后CDKL5作為腫瘤治療的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 載體pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA(紐恩生物科技公司)、細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)corning)、所有培養(yǎng)基及添加劑(美國(guó)Gibco)、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)、MTT即3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，中文名3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(上海生工公司)、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(美國(guó)，sigma)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87使用MEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1% Glutamax和1%青霉素+鏈霉素、1%非必需氨基酸和1%(1 mmol)丙酮酸鈉。細(xì)胞均置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度100%，CO2濃度5%。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 利用慢病毒感染人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87同時(shí)導(dǎo)入CDKL5 shRNA，構(gòu)建CDKL5 shRNA所用的載體為pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA。實(shí)驗(yàn)涉及的shRNA序列為shCDKL5 R：5’-3’CCGGGGAGCCTATGGAGTTGTAC TTCAAG；F：5’-3’ AGAGTACAACTCCATAGGCTCCTTTTTTG。質(zhì)粒委托紐恩生物技術(shù)公司包裝制成慢病毒顆粒濃縮液。

1.2.3 蛋白免疫印跡 分別提取細(xì)胞蛋白和組織蛋白，BCA定量后(碧云天)進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)，上樣量為45 μg/孔。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上(200 mA電流，室溫轉(zhuǎn)膜2 h)，用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2 h，將稀釋后的一抗稀釋液敷于膜上，4 ℃過(guò)夜。清洗一抗3遍后，1000∶1加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗，室溫孵育1 h，清洗二抗后，用ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行顯色。在暗室中將X光片放入膜上曝光,再進(jìn)行顯影、定影反應(yīng)。將膠片進(jìn)行掃描，用Image J軟件測(cè)定蛋白條帶灰度,復(fù)制數(shù)據(jù)到Excel表中分析蛋白表達(dá)量差異。

1.2.4 MTT分析 MTT粉末用D’Hanks配成5 mg/ml的溶液，濾膜過(guò)濾，4 ℃避光保存。 慢病毒感染4 d后，消化細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備1×104/ml的細(xì)胞懸液。在96孔培養(yǎng)板的每孔中加入150 μl懸液，即1500個(gè)細(xì)胞/孔。自4 h細(xì)胞貼壁始，每隔24 h在一個(gè)培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入15 μl的MTT溶液，共5 d。37 ℃孵育4 h。吸去培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO，在酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下的吸光值。此絕對(duì)吸光值減去對(duì)應(yīng)DMSO的吸光值，為相對(duì)吸光值。

1.2.5 細(xì)胞周期分析 收集細(xì)胞加入2 ml -20 ℃預(yù)冷的70%乙醇，重懸，-20 ℃固定過(guò)夜。離心后棄上清，用50 μg/ml(Thermo Scientific公司)重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃孵育30 min。1 mg/ml的碘化丙啶儲(chǔ)存液(Sigma-Aldrich公司)按1∶20加入到細(xì)胞懸液中，37 ℃避光孵育30 min。用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD Bioscience公司)檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞。FlowJo軟件分析DNA倍體(FLH2通道熒光強(qiáng)度)和細(xì)胞數(shù)，即細(xì)胞周期分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，t檢測(cè)分析組間的顯著性差異。P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 CDKL5在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87中的表達(dá)情況 由結(jié)果所示，在U87細(xì)胞系中CDKL5分為2個(gè)亞型，在細(xì)胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)(見(jiàn)圖1A)；通過(guò)shRNA 敲減CDKL5的可以有效降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的CDKL5的表達(dá)(見(jiàn)圖1B)；敲減CDKL5后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，由原來(lái)長(zhǎng)梭形變得不規(guī)則(見(jiàn)圖1C)。

2.2 敲減CDKL5抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng) 通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，敲減CDKL5會(huì)顯著抑制細(xì)胞增殖，MTT分析顯示，敲減CDKL5抑制U87細(xì)胞的活性降低(見(jiàn)圖2A)；流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，敲減CDKL5后U87細(xì)胞的進(jìn)程被阻止在G2/M期(見(jiàn)圖2B)。

A.膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中不同CDKL5蛋白亞型在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的分布；B.蛋白免疫印跡檢測(cè)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87中CDKL5蛋白的表達(dá)。細(xì)胞表達(dá)有對(duì)照shRNA(Control)或敲減CDKL5的shRNA(shCDKL5)；C.敲減 CDKL5 引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞形態(tài)的改變。 放大倍數(shù)，×200；標(biāo)尺， 50 μm

圖1 CDKL5在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87中的表達(dá)

A.血細(xì)胞技術(shù)法分析細(xì)胞增殖和MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；B.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布

3 討 論

此前研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的CDKL5是抑癌蛋白。神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y中，過(guò)表達(dá)CDKL5將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期而抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，而敲減CDKL5則產(chǎn)生相反的表型[8～10]。然而，此研究的初衷并非為了考察腫瘤中CDKL5的表達(dá)和功能，而是仍然關(guān)注CDKL5與神經(jīng)疾病的關(guān)系。我們認(rèn)為這些結(jié)果表明CDKL5能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的分化和神經(jīng)元的成熟，并結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)CDKL5可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞周期蛋白來(lái)促進(jìn)分化的[11～13]。或許是膠質(zhì)細(xì)胞中CDKL5低表達(dá)的緣故，至今未有研究關(guān)注CDKL5對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞成熟的影響和在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CDKL5蛋白具有多個(gè)亞型，前期也有相關(guān)報(bào)道，CDKL5的亞型分類與定位[14,15]。我們發(fā)現(xiàn)亞型之一的CDKL585在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87的細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，敲減CDKL5后抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。后期我們可以檢測(cè)在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中CDKL5的表達(dá)情況與腫瘤特性的相關(guān)性，我們的研究可以為以后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供新的理論基礎(chǔ)。