曾 臻，倪健斌，史 博，譚強(qiáng)來*

(1.廈門醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361023；2.廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，福建 廈門 361102)

福建牡蠣(Crassostreaangulata)是我國南方貝類養(yǎng)殖的主要種類，近年來其商業(yè)價值不斷增加，對福建牡蠣生殖調(diào)控的研究在養(yǎng)殖中具有重要的應(yīng)用價值[1]。此外，牡蠣是分析河口污染情況的環(huán)境指示種，養(yǎng)殖環(huán)境中大量的污染物可以通過擾亂牡蠣的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)影響牡蠣的生理活動，因此對牡蠣內(nèi)分泌機(jī)制的研究顯得格外重要。然而目前國內(nèi)外有關(guān)貝類生殖內(nèi)分泌的研究卻十分有限。

類固醇激素(Steroid hormone)是最主要的一類性腺激素，包括雄激素、雌激素和孕酮等。目前，在包括頭足綱、雙殼綱和腹足綱在內(nèi)的不少軟體動物組織中均檢測到類似脊椎動物性類固醇激素物質(zhì)的存在[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)這些性類固醇激素參與了貝類的生殖調(diào)控，在貝類的性腺發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。然而，關(guān)于類固醇激素在貝類中是如何發(fā)揮作用的機(jī)制還不甚清楚。Wang等[4]用放射性配體結(jié)合實驗的方法在海扇貝(Placopectenmagellanicus)性腺組織中檢測到2個雌激素結(jié)合位點(diǎn)，競爭性結(jié)合實驗進(jìn)一步證明這兩個結(jié)合位點(diǎn)具有特異性結(jié)合雌激素的能力，并且這種作用在配子發(fā)生的早期更加明顯。另外，Wang等[5-6]還發(fā)現(xiàn)用脊椎動物類固醇激素受體拮抗劑(如1.25 μM它莫西芬、2.5 μM氟他胺、1.00 μM美服培酮)可以阻斷類固醇激素在海扇貝中的生物學(xué)作用。這些研究結(jié)果表明在貝類中可能同樣存在由雌激素介導(dǎo)的生殖調(diào)節(jié)機(jī)制，并且可能是通過激活其受體來發(fā)揮作用的。

研究發(fā)現(xiàn)，貝類中類固醇激素合成的底物與脊椎動物同樣是膽固醇和孕烯醇酮[7-8]。但目前有關(guān)貝類中類固醇激素合成和代謝機(jī)制的研究較少，而且比較零散。其中3β-羥化類固醇脫氫酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenases，3β-HSDs)為類固醇激素合成代謝通路中的一種關(guān)鍵酶。3β-HSD可以催化孕烯醇酮或脫氫表雄酮生成有活性的孕酮和雄烯二酮。研究者在蝸牛(HelixpomatiaL.)[9]、真蛸(Octopusvulgaris)[10]、紫貽貝(Mytilusedulis)[11]和海蛞蝓(Ariolimaxcalifornicus)[12]等軟體動物的性腺組織提取物中也檢測到了3β-HSD的這種活性。此外，Krusch等[9]還發(fā)現(xiàn)蝸牛卵巢中3β-HSD在產(chǎn)卵前的活性明顯高于排卵后，這預(yù)示了其在蝸牛生殖活動中的重要功能。

本研究擬通過對福建牡蠣性類固醇激素合成相關(guān)酶3β-HSD的基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能探究，分析其時空表達(dá)特征，以及在牡蠣細(xì)胞中的定位，為闡明牡蠣內(nèi)源性類固醇激素的合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究牡蠣生殖內(nèi)分泌機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用福建牡蠣購自福建省漳州市斗美村漁排，重量為3.8～14.0 g/只。參考Foighil等[13]和Folmer等[14]的方法，根據(jù)線粒體COI基因片段序列特征進(jìn)行種的鑒定，確定所采樣品為福建牡蠣。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察[15]，將所采樣品分為四個階段：增殖期、生長期、繁殖期和排放期，每個時期選取15只雄性和15只雌性作為本研究的實驗對象。打開牡蠣殼后，取每個時期牡蠣不同組織(性腺、閉殼肌、外套膜、鰓、內(nèi)臟團(tuán))放入液氮中速凍后保存于-80℃冰箱中備用，同時取一小塊成熟期性腺組織固定于4%多聚甲醛溶液中(4℃固定過夜)。

1.2 RNA提取

分別將樣品置于Trizol?Reagent(Invitrogen，USA)勻漿。按照Trizol使用說明書，分別從牡蠣不同組織提取總RNA，通過1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結(jié)合Nanodrop ND-2000分光光度計檢測RNA的濃度和純度。

1.3 3β-HSD基因cDNA全長序列的克隆

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN，China)步驟分別對所得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA?；诒緦嶒炇覙?gòu)建的福建牡蠣轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選獲得的3β-HSD基因的序列片段，按照Full-RACE Core Set Ver.2.0 試劑盒(TAKARA，China)要求，分別設(shè)計并合成5′和3′ RACE特異性引物(引物序列見表1)，按照試劑盒說明書對福建牡蠣3β-HSD基因進(jìn)行5′和3′ RACE擴(kuò)增，將所得序列產(chǎn)物進(jìn)行純化，并送至廣州英韋創(chuàng)津(Invitrogen)生物技術(shù)公司進(jìn)行測序分析。

表1 實驗所用引物序列

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)Quanta cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN，China)的說明書，以2 μg總RNA為模板，Oligo-dT15為引物，通過Quanta反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈。以cDNA第一條鏈為模板，以牡蠣Elongationfactor1α基因(EF1α，GenBank accession No.BQ426516)作為內(nèi)參基因[16]，同時預(yù)實驗也證明該內(nèi)參基因在福建牡蠣不同組織及不同性腺發(fā)育階段的表達(dá)量十分穩(wěn)定(表1)。運(yùn)用SYBR GreenⅠ染料法在ABI 7500 fast system real-time PCR系統(tǒng)(Applied biosystems，USA)上定量分析不同時期牡蠣3β-HSD基因的mRNA表達(dá)變化。每個實驗組設(shè)置5個平行樣，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)孔。每輪反應(yīng)均設(shè)有cDNA實驗組、陰性對照組(用DNaseⅠ處理過，但沒有進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的RNA)和空白對照組(PCR水)。通過系列梯度稀釋樣品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計算本次qRT-PCR中所用引物的擴(kuò)增效率E范圍均處在95%～100%(R2>0.99)(表1)。qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測均為150 bp大小的單一產(chǎn)物。本實驗所使用的試劑盒為SYBR Green qPCR Kit(Thermo，USA)，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃ 10 min；95℃ 20 s，52℃ 20 s，72℃ 20 s，35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對每個基因的熔解曲線進(jìn)行分析。

所得數(shù)據(jù)用ABI 7500 system SDS 軟件(Version 1.4，Applied biosystems)進(jìn)行分析，用2-ΔΔCT法(ΔCt=CtcaVg-CtEF1α，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt校準(zhǔn)組)計算目的基因的相對表達(dá)量[17-18]。

1.5 原位雜交

根據(jù)獲得的3β-HSD基因序列，設(shè)計雜交探針的引物(表1)，參考Ni等[19]的方法對1.1中固定于4%多聚甲醛溶液中(4℃固定過夜)的成熟性腺組織進(jìn)行原位雜交。

1.6 目的基因的生物信息學(xué)分析

用BLAST軟件(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列同源性比對；用DNAMAN軟件進(jìn)行比對拼接，得到基因的全長序列；用Compute pI/Mw tool(http：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測等電點(diǎn)和分子量；用SignalP 3.0 軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)尋找信號肽；用TMHMM軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；用Predict Protein 軟件(http：//www.predictprotein.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域；用CLUSTALX軟件進(jìn)行多重序列比對；用MEGA 4.0軟件中的鄰接法(1000 bootstrap replicates)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 福建牡蠣3β-HSD基因的序列全長及特征

如圖1，福建牡蠣3β-HSD基因(ca3β-HSD)cDNA序列全長1 444 bp，5′-UTR(5′-Untranslated region)長165 bp，3′-UTR長210 bp，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)長1 068 bp。該基因可編碼356個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為39.796 kDa，等電點(diǎn)為8.32。經(jīng)SignalP和TMHMM軟件預(yù)測可知ca3β-HSD的氨基酸序列在AA274～AA296存在1個跨膜結(jié)構(gòu)。ca3β-HSD的氨基酸序列含有3β-HSD保守的結(jié)構(gòu)域(AA3-AA348)，該結(jié)構(gòu)域包括了1個酶活性中心YGGTE(AA149～AA153)和1個輔酶結(jié)合位點(diǎn)TGGAGFLG(AA7～AA14)，其中YGGTE結(jié)構(gòu)是短鏈脫氫酶保守的結(jié)構(gòu)特征。

2.2 福建牡蠣3β-HSD基因的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

多重序列比對的結(jié)果表明，ca3β-HSD氨基酸序列與其他動物的相似性為33%～99%，其中與太平洋牡蠣(Crassostreagigas)相似性最高(圖2)。用MEGA 4.0軟件以鄰接法(1 000 bootstrap replicates)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析ca3β-HSD與其他物種的同源關(guān)系。進(jìn)化樹顯示，3β-HSDs分別在脊椎動物和無脊椎動物聚為兩大枝。而在無脊椎動物中，兩種牡蠣的3β-HSDs最先聚類，接著再與其他無脊椎動物如節(jié)肢動物、棘皮動物和脊索動物等聚類(圖3)。

圖2、3中各物種3β-HSD氨基酸序列在NCBI上的登錄號如下：太平洋牡蠣(Crassostreagigas)，EKC29143；紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)，XP_797239；捕食螨(Metaseiulusoccidentalis)，XP_003746390；硬蜱(Ixodesscapularis)，XP_002434360；柱頭蟲(Saccoglossuskowalevskii)，XP_002738669；家鼠(Musmusculus)，NP_694873；斑馬魚(Daniorerio)，AY279108；草雀(Taeniopygiaguttata)，NM_001048264；紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)，XM_003962237；非洲爪蟾(Xenopustropicalis)，XM_002940984；紅原雞(Gallusgallus)，NM_205118；稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)，JN858104；青鳉(Oryziaslatipes)，NM_001137565；智人(Homosapiens)，AAA51831；斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)，F(xiàn)J807731；西非低地大猩猩(Gorillagorillagorilla)，XP_004026492。

2.3 福建牡蠣3β-HSD基因在不同組織中的表達(dá)

如圖4所示，3β-HSD基因在福建牡蠣性腺、外套膜、閉殼肌和內(nèi)臟團(tuán)中均有表達(dá)，而在鰓組織中幾乎沒有表達(dá)，性腺中3β-HSD基因的表達(dá)量最高，約為其他組織的2～10倍(P<0.05)，卵巢中的表達(dá)量略高于精巢。

注：*表示差異顯著。

Notes:*was significant difference.

2.4 福建牡蠣3β-HSD基因在生殖周期中的表達(dá)模式

圖5反映了福建牡蠣生殖周期中性腺3β-HSD基因的表達(dá)量變化。從增殖期到成熟期，3β-HSD基因的表達(dá)量持續(xù)增高，并在成熟期達(dá)到最大值(P<0.05)，但在配子排放后，其表達(dá)量急劇下降(P<0.05)。3β-HSD基因的這種表達(dá)量變化趨勢在雌性個體和雄性個體中基本一致。

注：不同小寫字母表示差異顯著，相同字母表示無顯著差異。

Notes:Different lowercase letters indicated significant difference,otherwise the same was no significant olifference.

2.5 福建牡蠣3β-HSD基因在卵巢中的細(xì)胞定位

原位雜交結(jié)果顯示3β-HSD基因在福建牡蠣卵巢中呈現(xiàn)出細(xì)胞定位，能與DIG標(biāo)記的3β-HSD基因的反義RNA探針雜交，顯色后呈藍(lán)黑顏色的陽性信號主要分布在卵細(xì)胞周邊的個體小的濾泡細(xì)胞上，而在成熟卵細(xì)胞上沒有發(fā)現(xiàn)有陽性信號(圖6)，這說明3β-HSD基因主要表達(dá)在福建牡蠣卵巢組織的濾泡細(xì)胞中。

注：a為常規(guī)HE染色結(jié)果；b為用反義探針雜交的陽性結(jié)果；c為用正義探針雜交的陰性對照；Fc為濾泡細(xì)胞；Oo為卵細(xì)胞。

Notes：a was hematoxylin-eosin staining；b was antisense probe；c was sense probe；Fc was follicle cell；Oo was oocyte.

3 討論

3β-HSD可以通過催化3β位上酮基和羥基間的轉(zhuǎn)化，能分別將孕烯醇酮或脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化為有活性的孕酮和雄烯二酮。催化反應(yīng)分為二步完成，第一步為3β位羥基脫氫，氧化輔酶NAD+為NADH；第二步為NADH激活△5-3-酮類固醇中間體構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的△4-3-酮類固醇構(gòu)象[20]。脊椎動物的3β-HSD具有不同的亞型，如人類3β-HSD具有2種亞型[21]，而大鼠有6種亞型的3β-HSD[22]。不同亞型的3β-HSD具有不同的組織分布特點(diǎn)和生物學(xué)功能，其中人類Ⅱ型3β-HSD和大鼠Ⅰ型、Ⅱ型3β-HSDs主要參與了類固醇激素的合成調(diào)節(jié)[23]。研究者在一些無脊椎動物(如絳蟲和孢子蟲)的體內(nèi)也檢測到3β-HSD的活性，并發(fā)現(xiàn)它能參與調(diào)節(jié)類固醇激素的合成，對生長和發(fā)育具有促進(jìn)作用。海兔、紫貽貝、真蛸和蝸牛等軟體動物的性腺組織提取物中也被證明含有能將孕烯醇酮、17α-羥基孕烯酮醇、脫氫表雄酮催化形成孕酮的3β-HSD活性[9-12]。Krusch等[9]還發(fā)現(xiàn)蝸牛卵巢中3β-HSD的活性變化與生殖活動緊密聯(lián)系，其在產(chǎn)卵前的活性顯著高于排卵后。以上結(jié)果表明3β-HSD可能同樣參與了貝類中類固醇激素的合成過程。Zhang等[24]在對太平洋牡蠣全基因組測序時獲得太平洋牡蠣中兩個亞型的3β-HSDs基因序列，分別是3β-HSD1型和3β-HSD2型，但氨基酸比對后發(fā)現(xiàn)這兩種亞型的3β-HSD同源性高達(dá)96%。除此之外，國內(nèi)外未見其他關(guān)于貝類3β-HSD基因研究的報道。本實驗用基因克隆的方法獲得了福建牡蠣3β-HSD基因全長序列，這是在貝類中獲得的首個3β-HSD基因全長。ca3β-HSD氨基酸序列具有酶活性中心和輔酶結(jié)合位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)域，而這些都是3β-HSD家族基因典型的結(jié)構(gòu)特征。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，福建牡蠣3β-HSD與其他物種具有較高的同源性。本次研究發(fā)現(xiàn)，福建牡蠣3β-HSD基因在性腺中高量表達(dá)，這與人、大鼠、鰻魚中Ⅰ型和Ⅱ型3β-HSD基因的組織分布特征相似[23]，也與性腺是貝類重要的生殖內(nèi)分泌器官是相對應(yīng)的。原位雜交的結(jié)果進(jìn)一步表明其主要表達(dá)在卵巢的濾泡細(xì)胞上，這與Matsumot等[25]、王丹等[26]、許茜等[27]用免疫組化的方法獲得的結(jié)果一致。此外，3β-HSD基因在福建牡蠣的生殖周期中呈現(xiàn)出與其他部分脊椎動物相似的表達(dá)模式[23]，并且與性類固醇激素水平的變化顯著相關(guān)，這預(yù)示了3β-HSD在福建牡蠣性類固醇激素的合成過程中可能發(fā)揮了重要作用。此外，福建牡蠣3β-HSD基因在雌、雄個體中表達(dá)量沒有明顯差別，這可能是由于3β-HSD的催化產(chǎn)物雄烯二酮或孕酮是雌二醇和睪酮合成共同的前體物質(zhì)。

本研究通過分子生物學(xué)的方法克隆獲得了福建牡蠣性類固醇激素合成酶重要基因3β-HSD的全長，并研究了其序列結(jié)構(gòu)特征和時空表達(dá)模式，證明了該基因指導(dǎo)合成的3β-羥化類固醇脫氫酶是牡蠣性類固醇激素合成過程中的關(guān)鍵酶，對調(diào)節(jié)牡蠣性類固醇激素的合成起著重要的作用；同時進(jìn)一步證明了貝類具有合成內(nèi)源性類固醇激素的能力。