周 怡，郭本月，魏萬權(quán)，袁小琛，梁旭方

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000；2.青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司，山東 青島 266000；3.青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司，山東 青島 266000；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

構(gòu)建細(xì)胞體外培養(yǎng)體系是魚類生理代謝機(jī)制研究的重要手段。與活體實(shí)驗(yàn)相比，采用魚類培養(yǎng)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象不僅實(shí)驗(yàn)成本低，可以精確控制實(shí)驗(yàn)條件，重復(fù)性、均一性也較好，還可以同時(shí)提供大量生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象[1-2]。這些優(yōu)點(diǎn)使得魚類細(xì)胞在生物學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，已被應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、腫瘤學(xué)以及資源保護(hù)等方面[3-5]。因此，深入研究魚類細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能推動(dòng)魚類生理相關(guān)理論研究，在實(shí)際應(yīng)用方面也具有一定意義。

神經(jīng)細(xì)胞系是開展神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)及生理機(jī)制研究的重要工具。近期國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了多種魚類腦細(xì)胞的培養(yǎng)工作，包括卡特拉魚、羅非魚、海鱸魚、玳瑁石斑魚、青石斑魚以及斜帶石斑魚等[6-12]。研究者多采用離體腦細(xì)胞進(jìn)行病毒感染及污染物毒理學(xué)研究，其應(yīng)用遠(yuǎn)不及哺乳動(dòng)物廣泛。本研究參考其他魚類相關(guān)研究成果，初步探討了草魚腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)，以期為研究魚類腦部生理規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制提供新的技術(shù)和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

草魚購于湖北仙桃排湖漁場(chǎng)，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水系統(tǒng)，選取健康且體表無損傷的個(gè)體，平均體重(187.50±8.42)g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

L-15液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品；CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay為Promega公司產(chǎn)品。青霉素、鏈霉素、兩性霉素分別配制成母液，經(jīng)0.22 μm濾過除菌，分裝，-20℃保存。PBS緩沖液：0.01M Na2HPO4、0.01M NaH2PO4、0.15M NaCl，pH 7.2，高壓滅菌，4℃保存。4.0%臺(tái)盼藍(lán)母液，用濾紙過濾，4℃保存，使用時(shí)用PBS將其濃度稀釋至0.4%。

1.3 細(xì)胞原代培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)草魚冰上麻醉，剪斷鰓部脈弓，放血約10 min，70%乙醇體表消毒。在無菌條件下，解剖取腦，以含有抗生素500 IU/mL青霉素和500 μg/mL鏈霉素及2.5 μg/mL兩性霉素的PBS緩沖液沖洗3次。分別采用不同方法嘗試進(jìn)行原代培養(yǎng)：1)組織塊培養(yǎng)法，用眼科剪將組織剪碎成約1～2 mm3的小塊。用完全培養(yǎng)基(10 % FBS，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL、兩性霉素2.5 μg/mL)浸潤(rùn)培養(yǎng)瓶，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，均勻排列，加入1 mL完全培養(yǎng)基，于28℃ CO2培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-18AIC)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的1～2 d內(nèi)避免移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以便組織塊貼壁，在2～3 d吸出培養(yǎng)基，添加3 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2)消化法，用眼科剪將組織切成2～3 mm3小塊，以便于消化。0.25%胰蛋白酶酶解處理，期間輕輕搖動(dòng)數(shù)次。消化液混濁則吸出少許消化液于顯微鏡鏡檢，若組織已分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)即終止消化。通過30 μm不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。600 rpm低速離心10 min收集細(xì)胞，完全培養(yǎng)基再懸浮，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)機(jī)械破碎法，在完全培養(yǎng)基浸潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將腦組織置于200目滅菌尼龍網(wǎng)上，采用無菌注射器的橡膠推頭輕輕擠壓使腦組織通過網(wǎng)孔，得到細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸液后通過 100目的尼龍網(wǎng)過濾，600 rpm低速離心 10 min 洗滌細(xì)胞一次，棄掉上清液后加入完全培養(yǎng)基重懸浮后，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞活力測(cè)定

細(xì)胞活力測(cè)定采用CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒測(cè)定。采用如1.3中機(jī)械破碎法制備細(xì)胞懸液，取出20 μL細(xì)胞懸液，加入等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，利用血球計(jì)數(shù)板快速估算細(xì)胞密度以及檢驗(yàn)細(xì)胞成活率[細(xì)胞成活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100]，當(dāng)細(xì)胞活力大于90%時(shí)可用。用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至2×106個(gè)/mL，細(xì)胞懸液分別接種到24孔及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁穩(wěn)定，在培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后，分別計(jì)數(shù)其細(xì)胞數(shù)及測(cè)定其細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，向培養(yǎng)板每孔中加入20 μL CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent溶液，黑暗中孵育 4 h后終止培養(yǎng)，490 nm波長(zhǎng)讀取吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

本實(shí)驗(yàn)采用臺(tái)盼藍(lán)檢驗(yàn)，死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染色，顯微鏡下可見為淺藍(lán)色細(xì)胞，而活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整使染料未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，顯微鏡下呈無色透明狀。顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，采用機(jī)械法分離制備的草魚腦細(xì)胞的細(xì)胞成活率達(dá)到92.2%，表明細(xì)胞存活率較好。

培養(yǎng)24 h后觀察到機(jī)械法培養(yǎng)腦細(xì)胞貼壁，呈不規(guī)則的多角形，貼壁的細(xì)胞多為上皮樣細(xì)胞形態(tài)，并匯合形成單層細(xì)胞(圖1A)。組織塊法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后觀察也多呈多角形，細(xì)胞形態(tài)與機(jī)械法類似，但是細(xì)胞貼壁數(shù)量較機(jī)械法少(圖1B)。而消化法獲得的近乎圓形的細(xì)胞較多，少量不規(guī)則的多角形細(xì)胞(圖1C)。

2.2 原代培養(yǎng)及細(xì)胞活力

在5 d培養(yǎng)期內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量如表1所示，培養(yǎng)24 h細(xì)胞數(shù)目為2.53×106個(gè)/mL，而培養(yǎng)48～72 h細(xì)胞數(shù)目明顯增多，約為原來數(shù)量的2.6倍，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)入衰退期，細(xì)胞數(shù)目減少至5.2×105個(gè)/mL。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間草魚腦細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目(106個(gè)/mL)

細(xì)胞活力隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖2所示，草魚原代腦細(xì)胞的活力在前3 d培養(yǎng)期內(nèi)基本保持穩(wěn)定，第4天開始下降，第4、5天的細(xì)胞活力分別比第1天下降了11.7%和34.8%，說明3 d培養(yǎng)期是進(jìn)行原代草魚腦細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)比較合適的時(shí)間段。

3 討論

目前，魚類細(xì)胞作為研究工具頗受關(guān)注，已經(jīng)被應(yīng)用到魚類腫瘤學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、遺傳學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、生理學(xué)和資源保護(hù)等方面。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比較，魚類細(xì)胞培養(yǎng)具有一定優(yōu)勢(shì)：細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化程度高、均一性好；魚類離體培養(yǎng)細(xì)胞尤其是原代培養(yǎng)細(xì)胞，其生理生化功能接近在體狀態(tài)，能夠快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而且可根據(jù)魚類生長(zhǎng)階段，進(jìn)行不同時(shí)期影響研究；可重復(fù)性高，離體條件下可以更為精確控制實(shí)驗(yàn)條件，有針對(duì)性地開展研究[1，3-4]。因此，本研究成功進(jìn)行了草魚腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)，為進(jìn)一步開展體外生理調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

魚類種類、年齡以及不同組織器官的生理結(jié)構(gòu)不同，不同細(xì)胞內(nèi)環(huán)境也存在很大差異，因此，不同組織器官材料的取材方法、培養(yǎng)方式以及培養(yǎng)條件也因細(xì)胞而異[5]。本實(shí)驗(yàn)嘗試了不同的培養(yǎng)方法以獲得草魚原代腦細(xì)胞。組織塊固定法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但是獲得單層細(xì)胞時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)胞得率較低。消化法細(xì)胞獲得量大，均一性較好，貼壁后可迅速形成單層細(xì)胞，但是要根據(jù)不同組織調(diào)整消化酶濃度以及消化時(shí)間，否則消化過度會(huì)損傷細(xì)胞。機(jī)械法操作同樣相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷較大，且細(xì)胞分散效果差于消化法，僅對(duì)纖維成分少的軟組織，如腦組織、胚胎組織較為適用[4]。本研究比較了以上三種培養(yǎng)方法，其中采用機(jī)械法獲得草魚原代腦細(xì)胞，細(xì)胞分散較為均勻、形態(tài)良好。

影響細(xì)胞體外培養(yǎng)效果的因素包括血清濃度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等。不同研究在進(jìn)行不同物種的腦細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所采用的體系不盡相同。血清濃度與培養(yǎng)基大多采用含有10%～20%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基[6-10]；哺乳動(dòng)物多采用37℃作為培養(yǎng)溫度，而在魚類培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中采用的溫度因種類不同而有所差異，如培養(yǎng)青石斑魚28℃[6]，斜帶石斑魚30℃/35℃[7]，羅非魚腦細(xì)胞25℃[7]，卡特拉魚腦細(xì)胞28℃[8]，海鱸魚22℃[9]，玳瑁石斑魚30℃[10]本研究用含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基在28℃進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的腦細(xì)胞，可能是由于物種不同，細(xì)胞培養(yǎng)條件也存在一定的差異。魚類是變溫動(dòng)物，在一定的溫度范圍內(nèi)可以保持細(xì)胞功能和生理的完整性，對(duì)于魚類細(xì)胞培養(yǎng)溫度的選擇方面尚無定論。草魚最適生長(zhǎng)溫度為25～32℃，而在27～30℃時(shí)代謝最為活躍，細(xì)胞培養(yǎng)最佳溫度與其基本一致。

細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)體系中保持活力，是進(jìn)行體外生理機(jī)制研究的基礎(chǔ)。本研究分離了草魚的原代腦細(xì)胞，而且可以獲得較高的細(xì)胞產(chǎn)率，從而可以滿足后續(xù)魚類腦部生理規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)的需要。并且本實(shí)驗(yàn)采用比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，代謝活躍的細(xì)胞將新型四唑化合物MTS生物還原成一種有色甲臢產(chǎn)物。結(jié)果顯示，原代腦細(xì)胞的活力可以穩(wěn)定地保持3 d，超過3 d后，細(xì)胞明顯退化。因此在當(dāng)前培養(yǎng)條件下所制備的原代魚腦細(xì)胞可用于部分生理機(jī)制的離體分析。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)魚類腦細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了大量研究[6-11]。利用魚類原代腦細(xì)胞進(jìn)行離體測(cè)試已得到應(yīng)用，主要包括魚類病毒感染與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[2，6，10-11]，以及持久性有機(jī)污染物的毒理學(xué)相關(guān)研究[12]；但是持久細(xì)胞系隨著代數(shù)的增加，其細(xì)胞的基因型和表型都有可能發(fā)生改變，導(dǎo)致某些重要的生理功能和分化特征喪失，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較差；而魚類細(xì)胞的原代培養(yǎng)是從活體動(dòng)物獲取組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原有組織的特性，在一定程度上更能反映體內(nèi)狀態(tài)，測(cè)試的結(jié)果比較準(zhǔn)確，重復(fù)性好[13-14]。

目前，魚類細(xì)胞培養(yǎng)已被應(yīng)用于魚類生理、毒理等分子機(jī)制研究，但是其應(yīng)用廣度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及其在哺乳動(dòng)物上的應(yīng)用。本研究進(jìn)行了草魚腦細(xì)胞原代培養(yǎng)的初步探索，后續(xù)需要開展進(jìn)一步的工作：完善細(xì)胞培養(yǎng)條件以建立持久細(xì)胞系；采用特定因子進(jìn)行細(xì)胞鑒定；利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)生理機(jī)制研究；開展離體實(shí)驗(yàn)與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，探討兩者區(qū)別與聯(lián)系，建立有效的評(píng)價(jià)指標(biāo)，使離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)應(yīng)，建立體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型。