高秋英,侯麗敏,張 玎,荀利如

(1陜西省人民醫(yī)院血液科,西安 710061;2陜西省人民醫(yī)院腎病血透中心;*通訊作者,E-mail:Wj-Xia78@126.com)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是起源于B細(xì)胞系并能夠產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白的惡性增殖性疾病,同時(shí)伴有廣泛的溶骨性病變和骨質(zhì)疏松;治療MM的方法有多種如造血干細(xì)胞移植。然而,目前MM仍不能完全治愈,易產(chǎn)生耐藥反應(yīng),并且患者最后多死于本病的復(fù)發(fā),如疼痛、感染、衰竭、腎功不全[1,2]。因此,尋找新的治療藥物迫在眉睫。

艾拉莫德是我國自行研發(fā)的一類新抗風(fēng)濕性藥物,具有獨(dú)特的抗炎作用,可有效緩解炎性疼痛、保護(hù)骨質(zhì)及促進(jìn)骨質(zhì)沉積?，F(xiàn)已經(jīng)作為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎一線推薦藥物。其能抑制免疫球蛋白及細(xì)胞因子生成,抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成[3,4],均與多發(fā)性骨髓瘤的治療機(jī)制不謀而合,提示艾拉莫德有望成為多發(fā)性骨髓瘤的潛在治療藥物。為了明確艾拉莫德對多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生發(fā)展的影響。本研究擬探討艾拉莫德對MM細(xì)胞增殖和凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞來源于中科院上海細(xì)胞庫,艾拉莫德片(25 mg,H20110084)由先聲藥業(yè)合成研究所提供,RPMI-1640培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司,胎牛血清來源于美國Hyclone公司,Hoechst 33258染色試劑購自碧云天生物技術(shù)公司。Notch1抗體均購自于美國Cell Signaling Technology,GAPDH抗體以及二抗均購買于Proteintech公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR PremixEx Taq試劑盒均購買于TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

將RPMI8226細(xì)胞復(fù)蘇后,加入含有10%血清的1640完全培養(yǎng)基,并放于條件為37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí),進(jìn)行傳代處理。艾拉莫德處理細(xì)胞24 h,檢測細(xì)胞活力,mRNA以及蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組為:對照組(0 μg/ml iguratimod),10 μg/ml艾拉莫德處理組,20 μg/ml艾拉莫德處理組,30 μg/ml艾拉莫德處理組。

1.3 MTT法檢測定細(xì)胞增殖

取處于對數(shù)生長期的RPMI8226細(xì)胞,0.25%胰酶消化并離心,以每孔5×103個(gè)的細(xì)胞密度均勻接種于96孔板,于條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞發(fā)生貼壁后,用濃度為0,10,20,30 μg/ml的艾拉莫德作用細(xì)胞24 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。于艾拉莫德作用終止前4 h,將20 μl濃度為5 mg/ml的MTT試劑加入到每個(gè)孔中并繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后棄去MTT溶液,再加入150 μl的DMSO并放置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，晶體溶解后,在波長大小為490 nm的條件下,使用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度。

1.4 Hoechst 33258染色檢測凋亡細(xì)胞形態(tài)

取處于對數(shù)生長期的RPMI8226細(xì)胞,并將其均勻接種到24孔板,待細(xì)胞發(fā)生貼壁后,給予不同濃度的艾拉莫德作用細(xì)胞24 h。棄去培養(yǎng)液,于搖床上用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次,每次1 min。每孔加入預(yù)冷的4%的甲醛(500 μl)固定細(xì)胞10 min,用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次,每次1 min。每孔加入500 μl Hoechst 33258染色液,4 ℃避光孵育10 min。再次用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次,使用熒光顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。正常細(xì)胞核呈現(xiàn)出彌漫且均勻的低強(qiáng)度熒光,凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核表現(xiàn)為濃染且致密的固縮形態(tài)或者顆粒狀熒光。

1.5 熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá)水平

使用Trizol提取細(xì)胞總RNA并測算濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照SYBR PremixEx Taq試劑盒相關(guān)說明書將模板cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng),并運(yùn)用LightCycler 480儀器檢測目的基因Notch1的表達(dá)。內(nèi)參基因是GAPDH基因,采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。Notch1的正向引物為5′-CACCCATGACCACTACCCAGTT-3′,反向引物為5′-CCTCGGACCAATCAGAGATGTT-3′。GAPDH的正向引物為5′-GACCTGACCTGCCGTCTA-3′,反向引物為5′-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3′。

1.6 Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平

艾拉莫德(0,10,20,30 μg/ml)處理細(xì)胞24 h,依照試劑說明書提取細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣品的蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),濕法轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜條件為恒流250 mA,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為120 min。5%脫脂牛奶封閉PVDF膜。于4 ℃條件下，分別用一抗稀釋液(anti-Notch1、anti-Bax、anti-GAPDH)過夜孵育PVDF膜,一抗稀釋比例為1 ∶1 000。用TBST洗膜3次,每次10 min。室溫用二抗孵育PVDF膜,孵育時(shí)間為60 min。TBST洗膜3次,每次10 min。用成像儀顯影,使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 艾拉莫德抑制人多發(fā)性骨髓瘤RPMI822細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示,10，20和30 μg/ml的艾拉莫德作用細(xì)胞24 h的RPMI822細(xì)胞活力分別為74.38% ± 3.35% ,52.16% ± 4.2% ,42.25% ± 4.15% ,顯著低于對照組(100% ± 0.00% ),并呈劑量依賴性(見圖1),提示艾拉莫德對增殖具有抑制作用。

與對照組比較,*P<0.05,* *P<0.01圖1 不同濃度艾拉莫德對RPMI822細(xì)胞增殖的影響Figure 1 The effect of different concentrations of iguratimod on RPMI822 cell proliferation

2.2 艾拉莫德促進(jìn)人多發(fā)性骨髓瘤RPMI822細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258染色結(jié)果顯示,10，20和30 μg/ml的艾拉莫德處理24 h,RPMI822細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、裂解現(xiàn)象,且隨著艾拉莫德作用濃度的增加,RPMI822細(xì)胞核固縮和裂解情況越嚴(yán)重(見圖2),提示艾拉莫德可誘導(dǎo)骨髓瘤RPMI822細(xì)胞凋亡。

2.3 艾拉莫德上調(diào)骨髓瘤RPMI822細(xì)胞促凋亡蛋白Bax的表達(dá)

Western blot法檢測了艾拉莫德作用下的骨髓瘤RPMI822細(xì)胞促凋亡因子Bax蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對照組(1.00 ± 0.00)比較,艾拉莫德(10,20,30 μg/ml)處理24 h可劑量依賴性地誘導(dǎo)RPMI822細(xì)胞促凋亡蛋白Bax的上調(diào)(分別為9.12 ± 0.15,4.06 ± 0.28,8.15 ± 0.19)(P<0.05,見圖3)。

圖2 Hoechst 33258染色觀察艾拉莫德對RPMI822細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 The effect of iguratimod on the apoptosis of RPMI822 cells

2.4 艾拉莫德抑制骨髓瘤RPMI822細(xì)胞Notch1 mRNA和蛋白的表達(dá)

本研究檢測了艾拉莫德對骨髓瘤RPMI822細(xì)胞Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,10,20,30 μg/ml的艾拉莫德處理RPMI822細(xì)胞24 h,Notch1 mRNA表達(dá)水平分別為0.51 ± 0.03,0.43 ± 0.02,0.36 ± 0.02;蛋白表達(dá)水平分別為0.63 ± 0.06,0.46 ± 0.04,0.32 ± 0.02。艾拉莫德處理后Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05),提示艾拉莫德對骨髓瘤RPMI822細(xì)胞Notch通路的活化具有抑制作用。

與對照組比較,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001圖3 不同濃度艾拉莫德對RPMI822細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的影響Figure 3 The influence of different concentrations of iguratimod on the expression of Bax protein in RPMI822 cells

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是B細(xì)胞惡性腫瘤,其發(fā)病率居血液系統(tǒng)惡性腫瘤第2位,雖然大劑量化療聯(lián)合自體骨髓移植較傳統(tǒng)化療有更好的療效,但鮮有患者能達(dá)到持續(xù)的長期緩解。發(fā)病率(2-3)/10萬,男女比例1.6 ∶1,常伴有溶骨性損害、高鈣血癥、腎臟損害等,致畸率高,由于免疫球蛋白等生成受抑,常常合并嚴(yán)重感染并導(dǎo)致臨床死亡[5,6]。MM嚴(yán)重威脅了人類的生存健康,傳統(tǒng)治療相關(guān)并發(fā)癥大,副作用高,費(fèi)用高,給患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)及心理壓力,尋找新的治療途徑的顯得十分重要。

艾拉莫德可有效緩解炎性疼痛、保護(hù)骨質(zhì)及促進(jìn)骨質(zhì)沉積[7,8]。艾拉莫德作為新型抗風(fēng)濕藥物,副作用輕,病人耐受性良好,對提高患者生活質(zhì)量、長期堅(jiān)持治療依從性好。其治療機(jī)制涉及抑制免疫球蛋白、細(xì)胞因子IL-6的生成,抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成等[9]。艾拉莫德的這些作用均為其治療多發(fā)性骨髓瘤提供了理論基礎(chǔ)。RPMI8226是一種常用的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株,現(xiàn)已被廣泛用于MM發(fā)病機(jī)制研究的體外模型[10-12]。為了探討艾拉莫德對多發(fā)性骨髓瘤的作用,本研究從細(xì)胞增殖和凋亡角度觀察了艾拉莫德是否影響人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226的生長情況。首先,MTT結(jié)果顯示,艾拉莫德處理RPMI8226細(xì)胞后,其細(xì)胞活力明顯降低,且具有劑量依賴性,提示艾拉莫德可對RPMI8226細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用。其次,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示,艾拉莫德處理的RPMI8226細(xì)胞凋亡率顯著增加,且隨著艾拉莫德作用濃度的增加而增加,表明艾拉莫德可誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德對RPMI8226細(xì)胞增殖的抑制作用以及對RPMI8226細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用,表明艾拉莫德具有抗MM發(fā)生的作用,進(jìn)一步拓展了艾拉莫德抗腫瘤作用[13]。

在哺乳動(dòng)物中,Notch家族的基因由高度同源的4種跨膜受體(Notch1-4)以及5個(gè)配體(Delta-like1,3,4和Jagged1,2)組成。Notch受體與配體之間的相互作用誘導(dǎo)了兩種蛋白水解,即細(xì)胞質(zhì)部分的釋放以及活化的Notch發(fā)生核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用,調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[14]。Notch信號通路具有進(jìn)化上高度保守的特點(diǎn),其能夠調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、增殖、形態(tài)發(fā)生,是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育的關(guān)鍵信號通路[15]。特別在哺乳動(dòng)物中,Notch通路能夠調(diào)節(jié)各種過程,如血管生成、肌生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和造血[14]。大量研究報(bào)道,異常活化的Notch信號通路參與了乳腺癌、肺癌以及多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16-18]。Skrtic等[19]發(fā)現(xiàn),原代MM細(xì)胞和體外培養(yǎng)的MM細(xì)胞株表達(dá)較高的Notch配體、Jagged1以及Notch受體。Notch1通過對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制,增強(qiáng)骨髓瘤細(xì)胞的抗藥效作用[20]。為進(jìn)一步探討Notch信號通路在艾拉莫德抑制MM細(xì)胞生長中的作用,本研究檢測了艾拉莫德作用下多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞活化的Notch水平。結(jié)果顯示,艾拉莫德處理RPMI8226細(xì)胞后,活化的Notch水平顯著降低,表明艾拉莫德可對Notch的活化產(chǎn)生抑制作用,提示艾拉莫德誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用與其抑制Notch通路的活化有關(guān)。本研究結(jié)果再次證實(shí)抑制Notch能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長[17,21]。

綜上,艾拉莫德可抑制人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長,作用機(jī)制可能與其抑制Notch的活化有關(guān)聯(lián),本研究的發(fā)現(xiàn)可為艾拉莫德抗腫瘤的作用提供理論依據(jù),同時(shí)也可為MM的臨床藥物治療提供新的靶點(diǎn)。