馬 楠,劉 亮,趙斯鈺,王 燕,李東景,徐曉科,汪 東

(西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,西安 710003;*通訊作者,E-mail:wangdong6928@163.com)

智力障礙/精神發(fā)育遲緩(mental retardation/developmental delay,MR/DD)是發(fā)病在18歲以前的兒童常見(jiàn)的致殘性疾病,發(fā)病率為2% -3%,主要特征為智力商數(shù)(IQ≤70)低下和社會(huì)適應(yīng)能力明顯障礙[1]。有大量研究顯示,智力障礙患者基因組存在拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)異常[2]。近年來(lái),有研究報(bào)道,高分辨單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)(array-based single nucleotide polymorphisms,aSNP)可提高15%-20%的認(rèn)知障礙性疾病、先天性多發(fā)畸形、孤獨(dú)癥樣癥候群患兒的病因檢出率[3]。然而,aSNP技術(shù)對(duì)智力障礙患兒CNVs異常檢測(cè)報(bào)道不一致,可能存在不同類型的智力障礙患兒分子遺傳基礎(chǔ)差異,aSNP技術(shù)對(duì)不同類型的智力障礙患兒的敏感性不一致。本研究旨在探討微陣列分析技術(shù)在不同類型智力障礙疾病檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值,以便為該類型患者臨床早期篩查提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究經(jīng)西安市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),選擇本院2015-06～2017-12間98例不明原因智力障礙患兒(U-MR)和90例癲癇伴智力障礙患兒(E-MR),由本院本科室中級(jí)職稱醫(yī)師操作,并進(jìn)行回顧性研究。U-MR患者入組標(biāo)準(zhǔn):①韋克斯勒智力量表(Wechsler intelligence scale for children,WISC)測(cè)評(píng)IQ分在70分以下;②患者排除圍產(chǎn)期感染、創(chuàng)傷、窒息、藥物中毒、營(yíng)養(yǎng)不良等外界因素;③患者外周血染色體核型分析結(jié)果正常;④排除已明確的癲癇綜合征、脆性X綜合征、Rett綜合征、脊髓性肌萎縮癥(SMA)及假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)等已知遺傳病;⑤年齡10-17歲,所有患兒均自幼即發(fā)現(xiàn)智力及運(yùn)動(dòng)發(fā)育較同齡兒落后,不伴有發(fā)育畸形患兒。體表畸形包括頭圍異常、眼距寬、通貫掌、腭弓高、耳異常、鼻異常等;其他先天畸形包括心臟、腎臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形等。

E-MR患者入組標(biāo)準(zhǔn):①臨床癥狀和腦電圖表現(xiàn)確診為兒童癲癇患者;其中包含46例全面性發(fā)作,44例局灶性發(fā)作;90例中包含10例全面性癲癇持續(xù)狀態(tài),16例局灶性癲癇持續(xù)狀態(tài)。②IQ分<70分;③年齡10-17歲,發(fā)病時(shí)間1-6年。兩組患兒性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 檢測(cè)基因組拷貝數(shù)變異

經(jīng)患兒家屬同意后,采集患者及其父母外周血各5 ml,EDTA抗凝,用于制備染色體和細(xì)胞懸液以及基因組DNA的抽提。采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根公司)說(shuō)明書操作提取DNA。全基因組拷貝數(shù)變異檢測(cè)使用的是Affymetrix公司的CytoScan HD芯片系統(tǒng)平臺(tái),其含有超過(guò)270萬(wàn)種探針,包括75萬(wàn)種可以分型的SNP探針,195萬(wàn)個(gè)拷貝數(shù)探針。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)經(jīng)正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)DGV數(shù)據(jù)庫(kù)(http://projects.tcag.ca/variation/)、異常表型數(shù)據(jù)庫(kù)(http://decipher.sanger.ac.uk/)、在線孟德爾遺傳性疾病數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)以及PUBMED進(jìn)行人工篩查、檢索比較分析是否有已知致病性CNVs,對(duì)致病性或可疑致病性CNVs則行FISH檢測(cè),并對(duì)父母進(jìn)行檢測(cè)做來(lái)源分析。據(jù)臨床分析,CNVs分三類:已確定導(dǎo)致遺傳病的致病CNVs(已知微缺失綜合征或微重復(fù)綜合征),潛在致病性CNVs(可能存在致病性CNVs,但尚不明確),對(duì)臨床意義不明的患兒CNVs,行父母外周血樣本aSNP檢測(cè),并判斷患兒CNVs是遺傳自父母還是新發(fā)。

2 結(jié)果

2.1 不明原因智力障礙患兒拷貝數(shù)變異分析結(jié)果

98例U-MR患兒中檢出10例CNVs(見(jiàn)表1),男6例CNVs,女4例CNVs,檢出率為10.2%;其中微缺失5例,微重復(fù)3例,其比例為5 ∶3。10例CNVs分別涉及7,11,15,16,18和X號(hào)染色體,其中15號(hào)染色體15q11.2(1例)、15q25.2(1例)和16號(hào)染色體16p11.2(2例)、16p13.11(2例)是主要發(fā)生異常改變的區(qū)域。CNVs包括5類:已知致病的微缺失/微重復(fù)綜合征1例,明確致病的微缺失/微重復(fù)(非綜合征)4例,染色體數(shù)目異常1例,臨床意義不明4例。10例CNVs中,3例微缺失/微重復(fù)片段<5 Mb,最小檢出缺失片段0.6 Mb。檢出已知致病性CNVs患兒中臨床表現(xiàn)除智力落后外,多伴矮小。檢出的4例臨床意義不明的CNVs中,2例為雜合性缺失(loss of heterozygotes,LOH),其區(qū)域不包含印記基因(見(jiàn)表1)。

2.2 癲癇伴智力障礙患兒拷貝數(shù)異常分析結(jié)果

90例E-MR患兒中檢出3例CNVs(見(jiàn)表1),男1例CNVs,女2例CNVs,檢出率為3.33% ;其中染色體數(shù)目異常2例,臨床意義不明1例。3例CNVs分別涉及17,21和X號(hào)染色體。此外,與U-MR患兒中檢出率(10.2% )比較,E-MR患兒檢出率更低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不明原因智力障礙10例拷貝數(shù)異常患兒臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室結(jié)果

3 討論

本研究首次利用aSNP技術(shù)對(duì)98例不明原因智力障礙(U-MR)和90例癲癇伴智力障礙(E-MR)患兒進(jìn)行CNVs檢測(cè),在U-MR中檢測(cè)出10例CNVs,總檢測(cè)率10.2% ;在E-MR中檢測(cè)出3例CNVs,總檢測(cè)率3.33% 。本研究結(jié)果說(shuō)明aSNP技術(shù)可能對(duì)不明原因智力障礙患兒檢測(cè)更敏感,其檢測(cè)率與Wu等[4]研究結(jié)果(5.1% )相比略有提高?？赡苁且?yàn)楸狙芯繉?duì)智力障礙患兒進(jìn)行亞型的分類,更有利于CNVs的檢測(cè),進(jìn)一步說(shuō)明aSNP技術(shù)在檢測(cè)CNVs時(shí)可能具有特異性,且提示U-MR患兒可能存在分子遺傳基礎(chǔ)病理機(jī)制,而E-MR是一類神經(jīng)系統(tǒng)病變導(dǎo)致異常疾病。

本研究結(jié)果顯示,98例U-MR患兒中檢出10例CNVs中5例為微缺失CNVs,3例為微重復(fù)CNVs,其比例為5 ∶3。與Cooper等[5]報(bào)道有輕微差異,他們的結(jié)果顯示缺失型是微重復(fù)的2倍,可能原因是本研究樣本小(98例),Cooper等[5]研究屬于15 767例的大樣本研究能更加真實(shí)地顯示樣本分布。本研究組將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本探討U-MR患兒的CNVs。

本研究結(jié)果顯示,U-MR患兒主要以15號(hào)染色體15q11.2、15q25.2和16號(hào)染色體16p11.2、16p13.2為主要發(fā)生異常改變的區(qū)域,與國(guó)外研究報(bào)道一致[6-8]。Stefansson等[9]研究顯示,15q11.2染色體的基因斷點(diǎn)BP1-BP2的缺失可能與患兒嚴(yán)重的生長(zhǎng)發(fā)育延遲、行為問(wèn)題有關(guān),并且損害患兒的認(rèn)知功能。也有研究報(bào)道,15q11.2(BP1-BP2)缺失會(huì)降低后扣帶回和島葉的灰質(zhì)體積,導(dǎo)致雙邊顳葉白質(zhì)減少和胼胝體增加,且呈現(xiàn)與拷貝數(shù)變異數(shù)量相關(guān)[9]?？赡苁且?yàn)锽P1-BP2間的染色體片段涉及4個(gè)基因:TUBGCP5、NIPA1、NIPA2和CYFIP1,后面3個(gè)基因廣泛在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá),TUBGCP5基因在下丘腦核團(tuán)表達(dá)。這些BP1-BP2微缺失均可能會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言發(fā)育延遲[8]。大量研究也已經(jīng)報(bào)道,染色體15q25.2拷貝數(shù)變異可能是小兒神經(jīng)精神疾病、生長(zhǎng)發(fā)育延遲的一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)基因,影響其認(rèn)知功能發(fā)育[5,10]。此外,也有研究報(bào)道,16p11.2(SH2B1)、16p13.2拷貝數(shù)變異聯(lián)系了精神分裂癥患者和生長(zhǎng)發(fā)育延遲[11,12]。16p13.11區(qū)域基因拷貝數(shù)變異在智力障礙患者中發(fā)生率達(dá)1‰[9]。因此,本研究結(jié)果提示15號(hào)染色體15q11.2、15q25.2和16號(hào)染色體16p11.2、16p13.2的拷貝數(shù)變異可能作為臨床早期篩查患兒智力障礙的靶基因。

有趣的是本研究發(fā)現(xiàn),90例E-MR患兒中檢出3例CNVs,檢出率為3.3% ,且顯著低于U-MR的檢出率(10.2% )。說(shuō)明E-MR與U-MR的發(fā)病機(jī)制不同,即E-MR不是分子遺傳基礎(chǔ)病理機(jī)制的疾病,而是一類神經(jīng)系統(tǒng)病變導(dǎo)致異常疾病,aSNP技術(shù)對(duì)E-MR篩查作用較U-MR小。提示不同的病因,臨床上U-MR和E-MR患兒應(yīng)制定不同的治療方案。

本研究存在一定缺陷,本研究觀察例數(shù)仍相對(duì)較少,需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本,以便證實(shí)基因拷貝數(shù)變異的臨床價(jià)值。此外,雖然目前微陣列比較基因組雜交技術(shù)(aCGH)或者aSNP,相比于傳統(tǒng)染色體核型分析而言,對(duì)認(rèn)知障礙性疾病、先天性多發(fā)畸形、孤獨(dú)癥樣癥候群患兒的病因檢出率有所提高[3],但是采用aSNP和aCGH技術(shù)對(duì)U-MR患兒檢出率報(bào)道仍不一致[13-15],將來(lái)研究需進(jìn)一步證實(shí)aSNP在U-MR患兒早期篩查中的臨床價(jià)值。