王 暉,李 瑤,鐘雪鋒,馬雅立,李傳保*

(1北京醫(yī)院腫瘤科,國家老年醫(yī)學(xué)中心,北京 100730;2北京醫(yī)院檢驗科,國家老年醫(yī)學(xué)中心;3北京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,國家老年醫(yī)學(xué)中心;*通訊作者,E-mail:lichuanbao3662@bjhmoh.cn)

游離DNA(cell free DNA,cf-DNA)是一種胞外DNA,主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成。健康人和腫瘤患者外周血中都存在cf-DNA[1],但腫瘤患者外周血cf-DNA的含量與健康人相比有顯著性的升高[2],且腫瘤患者外周血cf-DNA存在基因突變、重組、缺失等[1],臨床研究表明,cf-DNA能有效反映患者整體的腫瘤負荷、惡性程度、轉(zhuǎn)移能力以及實時的基因突變信息,與腫瘤組織的基因信息呈一定相關(guān)性[3]。通過對血漿cf-DNA測序檢測腫瘤相關(guān)的基因拷貝數(shù)變化[4]、甲基化變化[5]、核苷酸突變變化[6]、染色體重排變化[7]等已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、用藥指導(dǎo)和檢測腫瘤發(fā)生情況[8],由于無法對血漿中小片段DNA進行精準提取,利用cf-DNA定量進行腫瘤等疾病的輔助實驗室診斷的報道很少。本研究通過兩步磁珠法提取肺癌患者血漿游離DNA中的小片段cf-DNA,以期獲得最佳的cf-DNA提取方法,為腫瘤等疾病的輔助實驗室診斷提供依據(jù)。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

收集2015-07～2015-09北京醫(yī)院的肺癌患者血漿樣本共15例,肺癌的診斷依據(jù)NCCN肺癌診斷指南[9];健康人血漿樣本15例。所有樣本均在患者簽署了書面知情同意書后收集。

1.2 主要試劑和儀器

cf-DNA采血管、磁珠法游離DNA試劑盒(美國Life公司),分離柱提取法提取游離DNA試劑盒(德國Qiagen公司),瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司),Quick-load@100 bp DNA ladder(美國Promega公司),Qubit濃度檢測試劑盒(美國Life公司),Agilent 2100生物芯片分析儀(美國Agilent公司)。

1.3 血液采集、處理、儲存

用cf-DNA采血管,分別采集15例肺癌患者和15例健康人抗凝血4-5 ml。4 h內(nèi)4 ℃以2 000 r/min離心10 min,取上清至2 ml離心管中,健康人血漿用50 ml離心管收集混勻,-20 ℃保存待用。

1.4 兩步磁珠法提取血漿cf-DNA

第一步分離:取2 ml離心管,加入500 μl樣本,再分別加入100 μl的Proteinase K(1 000 μl)的Lysis Buffer和50 μl的磁珠,渦旋振蕩混合均勻,將離心管置于55 ℃孵育20 min(每10 min渦旋振蕩10 s),將離心管置于磁力架上6 min,至溶液澄清,吸取上清至另一15 ml離心管中,編號2。800 μl 80%的乙醇洗滌磁珠2次,晾干磁珠,加入50-100 μl水重懸磁珠,55 ℃孵育10 min,將離心管置于磁力架上2 min,吸取上清至一個新的離心管中即為第一步分離的DNA。

第二步分離:于編號2離心管中加入100 μl磁珠和1 150 μl的Binding Buffer,渦旋振蕩混合均勻,將離心管在室溫靜置20 min(每隔10 min渦旋振蕩10 s),將離心管置于磁力架上6 min至溶液澄清,棄上清。1 600 μl Washing BufferⅠ洗滌2次，1 600 μl Washing Buffer……洗滌1次，800 μl Washing Buffer……洗滌1次，晾干磁珠，加入50-100 μl Elution Buffer重懸磁珠，55 ℃孵育10 min，將離心管置于磁力架上2 min，吸取上清至另一新的離心管中，即為第二步分離的DNA。

1.5 分離柱提取法提取血漿cf-DNA

分離柱提取法提取血漿cf-DNA選取Qiagen游離DNA提取試劑盒提取,操作步驟見試劑盒說明書。

1.6 cf-DNA定量、片段大小分布檢測

用Qubit DNA濃度檢測試劑盒檢測不同方法提取的DNA濃度,2%的瓊脂糖凝膠分離DNA,凝膠成像分析片段大小分布。采用Agilent 2100生物芯片分析儀對DNA片段大小分布進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩步磁珠法DNA回收量與摻入標準品DNA片段濃度呈正相關(guān)

為評估磁珠法對血漿小片段cf-DNA的提取效率,選取127 bp和208 bp標準品DNA片段等摩爾濃度梯度摻入健康人血漿,濃度梯度為0，7.5，15，30，60，120 ng/ml,采用兩步磁珠法提取血漿中DNA標準品。結(jié)果表明,第一步提取的DNA濃度與摻入標準品DNA片段濃度不相關(guān)(P=0.711 6),DNA濃度相對恒定;第二步提取的DNA濃度與摻入標準品DNA濃度呈正相關(guān)(r2=0.971 6,P<0.001,見圖1)。結(jié)果提示,兩步磁珠法可有效提取血漿中小片段DNA。

圖1 兩步磁珠法提取DNA濃度及其相關(guān)性分析Figure 1 Concentration of DNA extracted by two-step magnetic bead method and its correlation analysis

2.2 兩步磁珠法可有效分離不同大小DNA片段

將100 bp DNA ladder加入到健康人血漿中,用兩步磁珠法和分離柱法分別提取摻入的標準品DNA。100 bp DNA ladder包含11個片段,大小范圍為100-1 000 bp,間距為100 bp,外加一條1 500 bp條帶。結(jié)果顯示,分離柱法僅可提取≤1 500 bp的cf-DNA片段,而兩步磁珠法可有效分離不同大小片段,第一步分離的DNA片段≥300 bp,第二步分離的DNA片段≤300 bp(見圖2)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與2100結(jié)果一致(見圖3)。

2.3 兩步磁珠法第二步分離的小片段cf-DNA濃度與腫瘤分期呈正相關(guān)

利用兩步磁珠法和分離柱提取法分別提取15例明確診斷為肺癌的患者的血漿cf-DNA,根據(jù)肺癌分期進行分組,分析各組間cf-DNA濃度差異。結(jié)果顯示,兩步磁珠法提取的血漿cf-DNA濃度與肺癌的分期相關(guān)(r2=0.866 4,P=0.004 9),而分離柱提取法提取的血漿cf-DNA濃度與腫瘤分期無顯著相關(guān)(見表1、圖4)。

表1 不同分期肺癌者血漿cf-DNA濃度 (ng/ml)

3 討論

正常人和腫瘤患者cf-DNA濃度范圍跨度很大,每毫升血液中約有0-5 400 ng cf-DNA。研究顯示,腫瘤患者cf-DNA濃度普遍高于正常人群[9]。cf-DNA是血漿中游離存在的DNA,它們有的來自于正常細胞,有的來自于異常細胞(如腫瘤細胞),其總量處于動態(tài)變化中。比如患者體內(nèi)腫瘤質(zhì)量達100 g,大約有3×1010個腫瘤細胞,每天約3.3%的腫瘤DNA進入血循環(huán)。進入血循環(huán)的cf-DNA片段大至21 kb,小至70-200 bp[10]。肝癌患者外周血腫瘤來源cf-DNA(circulating tumor DNA,ct-DNA)小于166 bp[5],在結(jié)直腸癌中80%的ct-DNA小于145 bp[11]。研究證明,cf-DNA水平和肺癌臨床復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后生存相關(guān),提示cf-DNA可成為臨床監(jiān)測腫瘤的有效指標[11]。目前,越來越多的研究支持cf-DNA測序在腫瘤療效評估方面具有重要意義,利用cf-DNA定量進行腫瘤等疾病的輔助實驗室診斷的報道很少。

由于cf-DNA的異質(zhì)性,利用cf-DNA定量進行輔助診斷的前提是對腫瘤來源的小片段cf-DNA的精準提取。傳統(tǒng)的cf-DNA提取方法有對酚氯仿異戊醇方法、分離柱提取法和磁珠提取法,Qiagen游離DNA分離柱提取試劑盒常被用于相關(guān)方法學(xué)研究的金標準[12],但無法分離不同大小片段游離DNA。本研究在磁珠提取法的基礎(chǔ)上,通過兩步洗脫對正常血漿中DNA標準品和肺癌患者血漿中cf-DNA進行提取,與Qiagen游離DNA分離柱法相比,本方法可分離不同大小片段的cf-DNA,同時有效提高血漿中小片段cf-DNA的比率。磁珠第一步分離可提取大片段的cf-DNA(≥300 bp),第二步分離可有效提取小片段的cf-DNA(≤300 bp)

利用兩種方法分別對15例確認肺癌患者的血漿cf-DNA進行提取,結(jié)果顯示兩步磁珠法第二步分離可提取小片段cf-DNA,同時其濃度與肺癌的分期呈正相關(guān),而分離柱提取法提取的DNA濃度與腫瘤分期無相關(guān)性。

上述結(jié)果提示,與分離柱提取法相比,兩步磁珠法可有效提取的腫瘤來源的cf-DNA,增加腫瘤基因檢測的準確性,降低檢測結(jié)果的假陰性。研究發(fā)現(xiàn)兩步磁珠法cf-DNA定量結(jié)果與肺癌的分期有一定相關(guān)性,提示利用cf-DNA定量輔助肺癌診斷有一定的可行性,由于入組病例較少,尚需較大量樣本研究的數(shù)據(jù)支持。