王胤康，呂 萌，許 琦，陳偉鴻，譚開祥，向極釬，劉 衛(wèi)*

（1.華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.武漢百思凱瑞納米科技有限公司，湖北 武漢430075；3.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510665；4.湖北思慧生物科技有限公司，湖北 恩施 445099；5.恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施445099）

青錢柳，俗稱搖錢樹，系胡桃科青錢柳屬植物，是我國特有的單種屬植物，分布于湖北、湖南、江西、貴州等地山區(qū)，長期以來民間取其葉制茶，飲之味甜兼有清熱解暑、降血壓、降血糖等保健功效[1]。青錢柳作為我國特有的保健食品資源，具有很高的應(yīng)用開發(fā)價值[2]。近年來研究表明，青錢柳葉含有多種生物活性物質(zhì)，如黃酮、多糖、皂苷、三萜類、蛋白質(zhì)、微量元素和酚類物質(zhì)等[3]，其水提物和醇提物具有顯著的降血糖效果[4-8]，但少有文獻(xiàn)探討青錢柳活性成分降血糖機(jī)制。

肝細(xì)胞是糖代謝作用的靶細(xì)胞之一，是攝取、儲存和合成葡萄糖的主要場所，在維持血糖穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著最直接和最重要的作用[9]。HepG2細(xì)胞是一種表型與肝細(xì)胞極為相似的人源肝癌細(xì)胞，具有肝細(xì)胞的形態(tài)和功能，且易于體外培養(yǎng)，同時HepG2細(xì)胞還具有表達(dá)胰島素樣生長因子和胰島素受體的代謝反應(yīng)。在高濃度的胰島素作用下，HepG2細(xì)胞表面胰島素受體數(shù)量下降，其下降程度與胰島素濃度及刺激持續(xù)的時間呈正相關(guān)[10]。因此HepG2細(xì)胞是體外研究胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制和降糖藥物作用機(jī)制的理想細(xì)胞模型[11]。α-葡萄糖苷酶是水解食物中多糖及二糖的常見酶，主要分布在小腸上。α-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制位于小腸內(nèi)的α-葡萄糖苷酶，使淀粉類多糖分解為葡萄糖的速率下降，延緩對葡萄糖的吸收，進(jìn)而降低餐后血糖升高速度，長期使用后亦可降低空腹血糖[12]。

為了從體外葡萄糖攝入量控制，以及體內(nèi)葡萄糖糖消耗兩方面來探討青錢柳活性成分降血糖機(jī)制，本研究采用高糖高胰島素培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞（IR-HepG2），觀察水提活性成分青錢柳多糖 （CPP）和醇提活性成分青錢柳黃酮（CPF）對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響，同時在體外進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活力抑制實驗，以探討青錢柳活性成分降血糖機(jī)制，為青錢柳降血糖保健食品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

青錢柳葉，采自湖北恩施思慧生物科技有限公司青錢柳苗圃基地；CPP與CPF由本實驗室參照文獻(xiàn)提取制備。

HepG2細(xì)胞，由武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

鹽酸二甲雙胍腸溶片 （生產(chǎn)批號：20150475），購自貴州天安藥業(yè)股份有限公司；葡萄糖試劑盒，購自上海名典生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自 HyClone公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT），購自Sigma公司；牛胰島素，購自Sigma公司；無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基，購自吉諾生物有限公司；阿卡波糖，購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司；α-葡萄糖苷酶（S10049），購自上海源葉生物有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

MQX200型酶標(biāo)儀，美國伯騰公司；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；3100型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Forma公司；WCD2S-03型微波萃取設(shè)備，南京三樂微波技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CPP的提取和純化參照文獻(xiàn) [13]加以改進(jìn)。青錢柳葉經(jīng)過石油醚脫脂脫色后，進(jìn)行提取，過濾，將所得濾液濃縮、醇沉、脫蛋白、干燥，得到棕紅色粗多糖。粗多糖復(fù)溶后，進(jìn)行透析、氧化鎂脫色、過濾并真空干燥，即得淡黃色精制CPP，經(jīng)硫酸蒽酮法[14]檢測多糖含量為66.3%。

1.3.2 CPF的提取和純化參照文獻(xiàn)[15]。青錢柳葉粉末（過40目篩）干燥后，經(jīng)微波萃取、過濾濃縮、噴霧干燥，得粉狀粗制品。將粗制品復(fù)溶，過聚酰胺吸附柱，控制流速2.5 mL/min，過柱完成后，用60%乙醇洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮并真空干燥。將真空干燥所得物再過2次聚酰胺柱，即得精制CPF，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[16]檢測，黃酮含量為80.5%。

1.3.3 CPF、CPP對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響參照文獻(xiàn)[17-18]。取活化后的HepG2細(xì)胞，用DMEM全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）培養(yǎng)至80%細(xì)胞貼壁后，改用含10 μg/mL胰島素的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后用無血清無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步化，即得IR-HepG2細(xì)胞。

用胰蛋白酶消化IR-HepG2細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min去上清，加入無血清無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基使其均勻懸浮，通過細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)并控制細(xì)胞濃度為105個/mL。實驗分為空白組、陰性對照組、模型組、二甲雙胍組（終質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0 mg/mL）、CPF與CPP低、中、高劑量組（終質(zhì)量濃度依次為0.01、0.1、1.0 mg/mL）。 取 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板點板，空白組每孔加入200 μL無血清無酚紅的DMEM高糖培養(yǎng)基，陰性對照組每孔加入200 μL正常HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液，模型組每孔加入200 μL IR-HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液，實驗組除每孔加入200 μL IR-HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液外，還加入相應(yīng)受試樣品。每組設(shè)置6個復(fù)孔，加藥孵育24 h后，以葡萄糖氧化酶法檢測上清液中的葡萄糖含量。以未接種細(xì)胞的空白組葡萄糖含量均值減去測得的培養(yǎng)液中葡萄糖含量，即得各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。孵育結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT 原液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)后，吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜終止反應(yīng)，微型震蕩器震蕩10 min至紫色結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀于490 nm波長下檢測各孔的光密度（OD）值，以光密度值反映細(xì)胞活性和數(shù)量的多少。

1.3.4 CPF與CPP對α-葡萄糖苷酶活力的影響參照文獻(xiàn)[19-20]，加以改進(jìn)。實驗分為空白組、陰性對照組 （不加抑制劑）、陽性對照組 （終質(zhì)量濃度1.00 mg/mL阿卡波糖）、不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的CPF與 CPP組 （終質(zhì)量濃度依次為 0.13、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）。 以 100 mg/mL 蔗糖溶液為底物，0.2 mol/L HAc-NaAc（pH 5.2）為緩沖液，所有試劑事先均于55℃預(yù)熱10 min，然后于1.5 mL EP管中，按照表1依次加入各試劑，55℃溫育60 min。溫育結(jié)束后，95℃水浴5 min終止反應(yīng)，取3 μL反應(yīng)液，分別加入450 μL葡萄糖工作液中，37℃水浴10 min后，492 nm波長處測定OD值，并計算抑制率。

式中：I表示抑制率；Y表示陰性對照組OD值；S表示待測樣品組OD值；K表示空白組OD值。

表1 實驗分組所加試劑Table 1 Reagents in each experimental group μL

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 （x±s）形式表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，p＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

由表2可知，與陰性對照組比較，模型組ΔGC與ΔGC/OD顯著性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05或p＜0.01），說明IR-HepG2細(xì)胞模型造模成功；與陰性對照組比較，二甲雙胍組、CPF低、中、高劑量組、CPP中、高劑量組 ΔGC顯著性增加（p＜0.01或p＜0.05）， 增率分別為 269.75%、40.12%、71.60%、125.31%、74.07%、94.44%；與陰性對照組比較，二甲雙胍組、CPF高劑量組、CPP中、高劑量組ΔGC/OD顯著性增加 （p＜0.01），增率分別為 415.47%、102.68%、89.29%、110.12%；與模型組比較，二甲雙胍組、CPF低、中、高劑量組和CPP低、中、高劑量組GC明顯上升 （p＜0.01），增率分別為 621.69%、173.49% 、234.94% 、339.76% 、96.39% 、239.76% 、279.52%；與模型組比較，二甲雙胍組、CPF低、中、高劑量、CPP中、高劑量組ΔGC/OD顯著性增加（p＜0.01）， 增率分別為 906.98%、137.21%、163.37%、295.93%、269.77%、310.47%。實驗結(jié)果表明，青錢柳活性成分 （CPF、CPP）能夠改善胰島素抵抗，增加IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量，且優(yōu)于正常HepG2細(xì)胞，其降血糖活性機(jī)制也可能與此有關(guān)。

表2 CPF與CPP對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（x±s，n=6）Table 2 Effect of CPFs and CPPs on Glucose Consumption of IR-HepG2 Cell（x±s，n=6）

以各組OD值與陰性對照組OD值的比值來反應(yīng)細(xì)胞存活率，計陰性對照組細(xì)胞平均存活率為100.00%，那么模型組細(xì)胞平均存活率為106.25%，二甲雙胍組細(xì)胞平均存活率為72.92%，CPF低、中、高劑量組細(xì)胞平均存活率分別為118.75%、127.08%、112.50%，CPP低、中、高劑量組細(xì)胞平均存活率分別為122.92%、93.75%、93.75%。由此可知，與陰性對照組比較，模型組，CPF低、中、高劑量組，CPP低、中、高劑量組細(xì)胞生長狀態(tài)良好存活率高，而二甲雙胍組細(xì)胞存活率較低，細(xì)胞生長狀態(tài)較差（見圖 1）。

圖1 實驗條件下細(xì)胞生長狀態(tài)Fig.1 Cell growth state under experimental conditions

由表3可知，阿卡波糖、CPF與CPP均能抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中CPF對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著質(zhì)量濃度升高呈正效應(yīng)，這與文獻(xiàn)[21]一致，當(dāng)CPF質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時抑制率最高達(dá)86.00%，而CPP對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨濃度變化不大。與阿卡波糖（1.00 mg/mL）比較，CPF（0.13、0.25、0.50、1.00 mg/mL）、CPP （0.13、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL） 對 α-葡萄糖苷酶的抑制率均顯著性低于阿卡波糖（p＜0.05或p＜0.01），而 CPF（4.00 mg/mL）對α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著性高于阿卡波糖（p＜0.01），表明以蔗糖為底物時，同等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CPF與CPP對α-葡萄糖苷酶的抑制效果不如阿卡波糖，這與劉杰等人以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）為底物所進(jìn)行的研究有所不同[12]，這可能與反應(yīng)條件以及α-葡萄糖苷酶對蔗糖與PNPG的親和力不同有關(guān)。

表3 CPF與CPP對α-葡萄糖苷酶的抑制作用（x±s，n=6）Table 3 Inhibition of CPF and CPP on alpha-glucosidase（x±s，n=6）

3 討論

葡萄糖是血糖主要來源，而葡萄糖的轉(zhuǎn)運活動是由葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUTs）介導(dǎo)完成的。GLUT4為一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族中最主要的葡萄糖運載體，存在于胰島素敏感的脂肪組織、心肌組織和骨骼肌組織中[22]。青錢柳提取物能夠顯著提高受試大鼠肝臟細(xì)胞GLUT4 mRNA表達(dá)量，進(jìn)而增加細(xì)胞對葡萄糖的消耗[23]。提示CPF可能發(fā)揮著信使分子的作用，促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞GLUT4 mRNA表達(dá)，進(jìn)而提高葡萄糖消耗量。參照文獻(xiàn) [24]，CPF還有可能通過激活A(yù)MPK磷酸化過程，來調(diào)節(jié)IR-HepG2細(xì)胞的糖代謝。根據(jù)文獻(xiàn)[25]，CPP提高IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的機(jī)理可能是通過活化Akt蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化過程，抑制GSK-3活性，阻止糖原合成酶被GSK-3磷酸化，進(jìn)而刺激糖原的合成，同時被激活的Akt蛋白激酶又可以促進(jìn)糖酵解過程，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的消耗。

食物中的淀粉類多糖，經(jīng)糖苷酶水解成小分子單糖后，才能被機(jī)體吸收轉(zhuǎn)化為血糖。青錢柳主要活性成分為黃酮、多糖等，通過α-葡萄糖苷酶活性抑制實驗發(fā)現(xiàn)，CPF與CPP能夠明顯的抑制α-葡萄糖苷酶活性，說明CPF與CPP口服進(jìn)入機(jī)體內(nèi)后，可能通過抑制位于小腸上的α-葡萄糖苷酶酶活性，使淀粉類多糖分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后血糖，改善機(jī)體對葡萄糖的耐受量。

4 結(jié)語

CPF與CPP能夠改善胰島素抵抗，提高IRHepG2細(xì)胞葡萄糖攝取量，抑制α-葡萄糖苷酶活性。本研究結(jié)果提示青錢柳提取物降血糖機(jī)制可能與CPF、CPP能夠增加外周細(xì)胞葡萄糖消耗量，抑制α-葡萄糖苷酶活性，延緩餐后血糖升高有關(guān)。