李雅迪，柳陳堅，龔福明，2，李曉然

（1.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明650500；2.德宏職業(yè)學院 基礎醫(yī)學部，云南 芒市 678400）

膽固醇又稱膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲衍生物，它通常以高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇等形式存在于血清脂蛋白中。隨著人民物質生活水平的普遍提高，人們通過日常飲食所攝取的膽固醇量也不斷增加，由此導致以血脂異常為主要表現(xiàn)的高脂血癥，進而誘發(fā)動脈粥樣硬化，引起以心腦血管疾病為首的一系列循環(huán)系統(tǒng)疾病。近年的研究表明，全世界每年大約有1 730多萬人死于心腦血管疾病，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[1]，而WHO（世界衛(wèi)生組織）的調查結果表明，動脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)生的主要病理基礎，血漿膽固醇尤其是低密度脂蛋白膽固醇升高更是動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的必備條件[1]，因此有效控制血清總膽固醇含量就成為預防心腦血管疾病的關鍵[2]。常用降膽固醇藥物雖然具有降膽固醇效果顯著、快速等優(yōu)勢，但是存在嚴重威脅人類健康的副作用[3]；如他汀類藥物就具有肌肉疼痛等副作用，該副作用最終導致橫紋肌溶解癥，也會導致肝臟細胞損傷，進而破壞人體內部新陳代謝系統(tǒng)的正常工作，相當數(shù)量的服藥人已經出現(xiàn)記憶力喪失或判斷功能混亂等癥狀。因此探尋能有效降低膽固醇且副作用小的防治方法勢在必行。

以不同形式服用益生菌，如酸奶和奶酪等發(fā)酵食品，可以帶來許多潛在的健康益處，包括降膽固醇作用。研究表明，服用益生菌可以降低血清膽固醇水平[4]。對大鼠進行的動物實驗表明，在高膽固醇飲食的同時飼喂益生菌 （植物乳桿菌和芽孢桿菌）可以有效降低大鼠血清中的甘油三酯、膽固醇及低密度脂蛋白的含量，減緩高膽固醇飲食對機體的傷害[5]。這些益生菌已經被建議用于降低膽固醇添加在食品中[6]。關于益生菌降低膽固醇水平的機制已經提出了許多假設，大多來自體外實驗，比如，益生菌細胞表面通過膽鹽水解酶活性結合膽固醇分子[7-8]；益生菌可以產生短鏈脂肪酸[9]；膽固醇與膽汁共沉淀[6]；膽固醇轉化為糞甾醇[10]等。最主要的機制應該歸因于膽鹽水解酶活性，大多數(shù)益生菌如乳桿菌屬、乳球菌屬和雙歧桿菌屬等常見的用于食品發(fā)酵的益生菌具有膽鹽水解酶活性[11-12]，這些益生菌產生的膽鹽水解酶可以裂解酰胺鍵[13]。應用益生性乳酸菌防治高膽固醇血癥所引發(fā)的心腦血管疾病，不僅效果顯著，而且?guī)缀鯚o任何毒副作用[14]。然而，研究表明，不同的菌株具有不同程度的降低膽固醇作用[15]。因此，本研究利用本研究室保存的云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品由來的益生乳酸菌實施膽固醇體外降解試驗，從中篩選膽固醇吸收同化率高的菌株，為后續(xù)降膽固醇功能性發(fā)酵食品的研發(fā)提供菌種保證和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

本研究所使用的菌株全部分離自云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品，詳見表1，目前均保存于昆明理工大學生命科學與技術學院應用微生物研究室。

1.2 實驗用主要培養(yǎng)基

①de Man-Rogosa-Sharpe（MRS）肉湯培養(yǎng)基（pH 6.2±0.2，Oxoid）；② MRS 改良瓊脂培養(yǎng)基[16-17]則需在每升MRS肉湯培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂、10 g CaCO3和 0.04 g溴甲酚紫（0.004%，w/v）；③ 降膽固醇菌株初篩培養(yǎng)基（g/L）：精確稱取膽固醇（磨碎）2.0；KH2PO41.6；MgSO4·7H2O 0.2；MnSO40.2；NH4NO30.2；NaCl 15；瓊脂 20；溶于去離子水；④降膽固醇菌株復篩培養(yǎng)基 （g/L）：精確稱取膽固醇（磨碎）0.15；蛋白胨 10.0；牛肉粉 8.0；酵母浸出液4.0；Tween-80 1 mL；K2HPO42.0； 乙 酸 鈉 5.0；MgSO4·7H2O 0.2；MnSO4·4H2O 0.05； 檸檬酸銨 2.0，溶于去離子水。

表1 具有降膽固醇能力益生性菌菌株的復篩結果Table 1 Re-screening of cholesterol-reducing probiotics

1.3 試驗用主要生化試劑及溶液

1.3.1 試驗用主要試劑膽固醇；KOH；甲醇；冰乙酸；正己烷；濃硫酸；上述試劑除特別注明外，所有試劑均為分析純。

1.3.2 試驗用主要溶液①FeSO4-冰乙酸-濃硫酸顯色劑[18]，將FeSO4100 mg溶于1 mL蒸餾水中，再加入100 mL冰乙酸混合溶解，然后與100 mL濃硫酸緩慢混勻，冷卻后備用；②膽固醇標準液，精確秤取0.192 g膽固醇，用蒸餾水定容至1 L，即得濃度0.192 mg/mL的膽固醇標準液，然后梯度稀釋得濃度依次為 0、0.048、0.096、0.144、0.192 mg/mL 的標準液。

1.4 主要儀器及設備

恒溫培養(yǎng)搖床（GHP-9160）：上海一恒科技有限公司；電子分析天平（YP1002N）：德國賽多利斯；超聲波細胞破碎機（SCIENTZ-ⅡD）：上海珂淮儀器有限公司；PCR 儀（2720）：ABI公司；高速冷凍離心機（Sigma 3-18K）：德國SIGMA公司；紫外分光光度計（Genova）：英國 GENOVA 公司；恒溫水浴槽（TR-1A）：日本 AS ONE 公司；電子天平（YP1002N）：上海恒平科學儀器有限公司；恒溫金屬?。↖C20）：日本AS ONE公司。

1.5 降膽固醇功能性益生菌的復篩

對初篩獲得的具有降膽固醇能力的益生菌菌株進行復篩，利用略作改良的皂化-比色法對初篩菌株的降膽固醇能力進行檢測[19]，具體步驟如下：將初篩得到的益生菌菌株用MRS液體培養(yǎng)基復壯兩次后，按4‰的接種量將菌株接種至5 mL復篩培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)72 h后，2 000 r/min離心取上清（4 ℃，10 min），隨后將 500 μL 上清與 2 500 μL飽和KOH-甲醇溶液（200 g/L）充分混勻，80℃水浴中皂化10 min，要求每隔1 min劇烈震蕩混勻一次。皂化結束后，將冷卻至20℃的皂化物與3 mL正己烷充分混勻1 min，然后靜置分層并取上層溶液離心（4 ℃，2 000 r/min，10 min）。 將離心上清1 mL 加入離心管中60℃干燥，待溶劑全部揮發(fā)后，用400 μL冰乙酸進行充分洗脫，最后在洗脫液中加入1 mL顯色劑，60℃金屬浴反應15 min，于490 nm波長下測定被測樣品的OD值。同法處理膽固醇標準液和空白對照樣品，以膽固醇標準液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。最終根據被測樣品的吸光度值計算樣品中膽固醇含量，并以公式計算菌株對膽固醇的去除率為

式中：a表示培養(yǎng)基初始培養(yǎng)時的膽固醇質量濃度；b表示培養(yǎng)結束后培養(yǎng)液中膽固醇質量濃度。

1.6 菌株的耐酸能力和耐膽鹽能力測定

1.6.1 菌株的耐酸能力測定用普通的MRS液體培養(yǎng)基對保存于-80℃的具有降膽固醇功能的益生菌進行復壯，在復壯2次后，按4‰接種量分別接至pH 2.0和pH 3.0的50 mL的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng) 3 h。 在 0、1、2、3 h 處分別提取 1 mL 樣品，10 000 r/min離心2 min收集菌體，再用滅菌的0.85%的生理鹽水洗滌并懸浮菌體。按一定的稀釋比例（10-1、10-2、10-3）稀釋菌體，將稀釋后的菌體涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)過后，用平板計數(shù)法觀察菌株在酸性條件后的生長情況。上述實驗重復3次。

1.6.2 菌株的耐膽鹽性能力測定培養(yǎng)基的配制：用牛膽鹽粉末配制含有0.3%、0.5%和1%膽鹽濃度的MRS培養(yǎng)基。用普通的MRS液體培養(yǎng)基對保存于-80℃的具有降膽固醇功能的益生菌進行復壯，在復壯2次后，按4‰接種量分別接至含0.3%、0.5%和1%膽鹽濃度的50 mL的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)12 h后，提取1 mL樣品，10 000 r/min離心2 min收集菌體，再用滅菌的0.85%的生理鹽水洗滌并懸浮菌體。按一定的稀釋比例（10-1、10-2、10-3）稀釋菌體，將稀釋后的菌體涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h。培養(yǎng)過后，用平板計數(shù)法觀察菌株在膽鹽條件后的生長情況。上述實驗重復3次。不含有牛膽鹽的無菌水作為空白對照。

1.7 Lb.plantarum S11體外降膽固醇機制初探

用MRS液體培養(yǎng)基對保存于-80℃的菌株Lb.plantarumS11進行復壯，在復壯2次后，按4‰接種量接至5 mL降膽固醇復篩培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)72 h，2 000 r/min 4℃離心10 min后，分別取菌體及上清液備用。同時，按4‰接種量將Lb.plantarumS11菌株接種至同體積的MRS培養(yǎng)基中作對照，37℃靜置培養(yǎng)72 h，2 000 r/min，4℃離心10 min后，分別取菌體及上清液備用。隨后用滅菌生理鹽水對上述兩實驗組中離心得到的菌體進行洗滌，然后再使用滅菌生理鹽水懸浮實驗組的菌體并定容至10 mL，同時使用滅菌生理鹽水將等量對照組的菌體懸浮并定容至10 mL，冰浴靜置10 min；加入溶菌酶（0.2 mg/mL）后，37℃孵育 15 min，孵育后超聲破碎菌體（功率950 W；時間15 min，工作3 s，間隔 5 s），最后 2000 r/min 4 ℃離心 10 min，收集上清即為菌體破碎后的無細胞上清液，沉淀溶于10 mL滅菌生理鹽水后即為菌體細胞碎片懸浮液。按照1.5節(jié)中的皂化-比色法檢測實驗組的培養(yǎng)上清、菌體破碎后上清液及菌體細胞碎片懸浮液中膽固醇含量，在測定培養(yǎng)上清時以陰性對照組進行調零，菌體破碎后的上清液及菌體細胞碎片懸浮液在測定膽固醇含量時使用滅菌的生理鹽水調零。另外，將復壯的Lb.plantarumS11菌株按4‰接種量分別接種至5 mL降膽固醇復篩培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)72 h，經梯度稀釋后取適宜濃度的稀釋液（10-6倍稀釋）涂MRS瓊脂平板進行計數(shù)。

1.8 數(shù)據處理與分析

本研究在檢測益生性乳酸菌菌株降膽固醇活性時所得實驗數(shù)據都經RSD值計算統(tǒng)計軟件處理得到，所得平均值和標準偏差均由兩個以上樣品的測量結果經計算得到，結果均以 “平均值±標準誤差”形式表示。

2 結果與討論

2.1 具有降膽固醇能力的功能性益生菌的復篩

通常除使用比色法篩選具有降膽固醇能力的功能性益生菌外，還使用酶法、液相色譜法、氣相色譜法及試劑盒分析法（酶法）等方法進行篩選，而這些方法與比色法相比，酶法由于技術含量較高，特異性強，而其他兩種方法又需要特殊的設備，所以都難于推廣使用[20]。本研究使用含膽固醇固體初篩培養(yǎng)基配以含膽固醇液體復篩培養(yǎng)基（膽固醇含量150 mg/mL），再以略加改良的皂化-比色法檢測膽固醇轉化率的兩步篩選體系篩選具有降膽固醇能力的益生菌菌株，該篩選體系與常用的高效液相色譜法及試劑盒分析法等方法相比，具有快捷簡便，分離篩選效率高，成本較低，適用于大規(guī)模篩選等優(yōu)點。經過皂化-比色法檢測，以標準膽固醇濃度為橫坐標，檢測波長為490 nm的吸光度值為縱坐標做線性回歸，得線性回歸方程y=1.36x-0.000 6，R=0.999（R2=0.999 7）。經檢測得到的在體外具有降膽固醇活性的21株益生性乳酸菌，依據16SrRNA基因序列比對，可將21株菌株分為5屬8種，乳桿菌屬（12 株）、片球菌屬（3 株）、魏斯氏菌屬（1 株）、腸球菌屬（4 株）、芽孢桿菌屬（1 株）（圖 1），且它們對膽固醇的吸收同化率為 3.30%（±0.89）～75.64%（±1.12）之間，平均吸收同化率為44.34%，共有14株益生菌的膽固醇轉化去除率高于平均值，而編號S11菌株的膽固醇吸收同化率更是高達75.64±1.12%（表 1）。在文獻[20]中，10株具有降低膽固醇含量的菌株中，乳桿菌屬（8株）、片球菌屬（2株），這些菌株對膽固醇的吸收同化率為12.10%～47.54%，其中Lb.agilisBK10-47的膽固醇吸收同化率為47.54%。本文篩選得到的編號S11菌株與之相比，其吸收同化率明顯高出。且在文獻[21]中，對供試菌株進行膽固醇吸收同化能力的檢測中，乳酸菌屬所占的比例最高，這與本文的研究結果相一致。

圖1 本研究中益生菌基于16S rRNA基因序列的菌種鑒定結果Fig.1 Classification of probiotics in this study by 16S rRNA gene sequencing

2.2 菌株耐酸能力和耐膽鹽能力測定

將上述復篩得到的具有降膽固醇能力的菌株進行耐酸和耐膽鹽能力的鑒定。模擬胃液的pH的濃度，通過體外培養(yǎng)菌株3 h，利用平板計數(shù)法測定菌株的耐酸性能力；在不同濃度的牛膽鹽MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌株12 h后，同樣利用平板計數(shù)法測定菌株的耐膽鹽能力，所得結果見表2。由表2可知，只有植物乳桿菌QB3-1、QB3-2、S11這三株菌株具有一定的耐酸和耐膽鹽能力。這三株菌株在培養(yǎng)環(huán)境達到pH 2.0時，還是可以生存的，證明這三株菌株還是具有一定的耐酸能力。在耐膽鹽能力實驗中，只有QB3-2可以在膽鹽濃度達到1%時還可以生長。QB3-1在膽鹽濃度為0.5%時，還是可以生長的。而植物乳桿菌S11的將彈股率最高，也具有一定的耐酸能力，但是在膽鹽存在的環(huán)境下，不可生長，初步推斷該菌株不含有膽鹽水解酶，即該菌株降膽固醇的機制是通過結合在細胞表面而被去除。

表2 益生菌的耐酸和耐膽鹽能力測定Table 2 Acid and bile tolerance of LAB strain probiotics （log cfu/mL）

表3 Lb.plantarum S11不同培養(yǎng)部分膽固醇含量變化Table 3 Changes of cholesterol content in different cultures of Lb.plantarum S11

2.3 菌株Lb.plantarum S11體外降膽固醇機制初探

本文通過植物乳桿菌在正常MRS培養(yǎng)基和含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用皂化-比色法分別檢測培養(yǎng)上清、破碎上清及細胞碎片懸浮液中膽固醇含量，然后通過比較各組分中膽固醇含量，初步分析Lb.plantarumS11菌株體外降膽固醇機制。對Lb.plantarumS11實驗組培養(yǎng)上清、菌體破碎的無細胞上清液及菌體細胞碎片懸浮液中膽固醇含量測定結果見表3，由表3可知MRS培養(yǎng)基更利于菌株Lb.plantarumS11生長，其菌體生物量可高達2.85×1014cfu/mL，而含膽固醇的復篩培養(yǎng)基則不利于該菌株生長，其菌體生物量則為4.20×109cfu/mL，但在這種不利的生長情況下，該菌株對培養(yǎng)基中所含膽固醇的去除率仍可高達79.17%，說明它具有極強的吸收同化膽固醇能力。在文獻[21]的研究中，4株分離于科菲谷物的植物乳桿菌通過平板計數(shù)法和測定膽固醇含量，得到乳酸菌同樣具有有對膽固醇吸收同化的能力。菌體對膽固醇可能有一定吸附能力，能通過吸附及摻入細胞膜的方式達到降低培養(yǎng)基中的膽固醇含量，但吸附及摻入細胞膜的作用非常微小，4.20×109cfu/mL的菌體僅能吸附沉淀0.002 mg的膽固醇（僅占1.30%）。由此可推測，吸收同化作用仍是Lb.plantarumS11菌株在體外降膽固醇的主要機制，而吸附及摻入細胞膜的降膽固醇機制僅是該菌株降膽固醇的次要途徑。正如在文獻[22]的研究中，通過菌株降低膽固醇含量能力的檢測得到上述體外降膽固醇可能的機制。膽固醇可能是通過吸收同化的作用被去除，也可能是促進膽鹽的降解而去除，或者是益生菌的死細胞和活細胞將膽固醇結合在細胞表面而去除。而且也有報道稱益生性酵母同樣也具有降低膽固醇的功效[24]。

綜上所述，云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品中確實存在具有降膽固醇功效的益生菌資源，而本研究所創(chuàng)建的具有降膽固醇功效益生菌的兩步篩選體系確實可行。因此，為研發(fā)降膽固醇功能性發(fā)酵食品，后續(xù)研發(fā)將以Lb.plantarumS11為主要研究對象，深入探討降膽固醇功能性發(fā)酵豆豉或食品開發(fā)的可能性。

3 結 語

1）本研究所創(chuàng)建的以降膽固醇菌株篩選的液體復篩培養(yǎng)基進行復篩并以皂化-比色法檢測膽固醇吸收同化率的兩步篩選體系確實可行，可用于云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉等傳統(tǒng)發(fā)酵制品中降低膽固醇量的菌株的分離與篩選。

2）通過鑒定復篩得到的具有降膽固醇能力的益生菌的耐酸和耐膽鹽能力，得到只有Lb.plantarumQB3-1、QB3-2、S11這三株菌株具有一定的耐酸和耐膽鹽能力。Lb.plantarumQB3-2既具有一定的耐酸能力，而且可以在膽鹽濃度為1%的環(huán)境下生存，但是Lb.plantarumQB3-1稍差于QB3-2。Lb.plantarumS11具有一定的耐酸能力，但是沒有耐膽鹽能力，故初步推斷該菌株不含有膽鹽水解酶，其降低膽固醇的機制很有可能是通過菌株細胞膜表面吸附而去除膽固醇。

3）本研究從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中成功分離到具有較高的降低膽固醇率的菌株Lb.plantarumS11，其膽固醇降低率可高達（75.64±1.12）%，篩選出降膽固醇率高的植物乳桿菌，可用于酸奶和其他發(fā)酵食品的制作，這樣的發(fā)酵食品在降低膽固醇的同時，它還可也能抑制其他潛在致病菌的生長、延長食品儲存時間。因此該菌株可應用于后續(xù)降膽固醇功能性發(fā)酵豆豉或食品的研發(fā)。

4）經本研究對Lb.plantarumS11體外降膽固醇機制初探，可知吸收同化作用是Lb.plantarumS11在體外降膽固醇的主要機制 （吸收同化率可達79.17%），而吸附及摻入細胞膜的降膽固醇機制僅是該菌株降膽固醇的次要途徑（僅占1.30%）。