陳建軍，郝之奎，廖祥儒，吳翰桂*

（1.臺州職業(yè)技術(shù)學院 應用生物技術(shù)研究所，浙江 臺州318000；2.江南大學 生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

生物拮抗菌是近年來食品微生物研究的熱點之一，逐步廣泛應用于食品防腐保鮮中領域。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）所產(chǎn)的抑菌活性物質(zhì)的研究越來越受到關注的菌株之一。其優(yōu)良的光譜抑菌效果在多種果蔬采摘之后保鮮應用中，是一種新型保鮮技術(shù)，它具有利于人體安全、不產(chǎn)生抗藥性、無污染等特點，有著廣闊的應用前景[1-2]。

解淀粉芽孢桿菌在其代謝過程中可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如張寶俊等從解淀粉芽孢桿菌LP-5發(fā)酵液分離得到的抗菌粗蛋白[3]。劉俏等分離得到的解淀粉芽孢桿菌活性蛋白[4]等均為抑菌蛋白。信珊珊等分離解淀粉芽孢桿菌WH1代謝產(chǎn)物得到產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)為Surfactin類脂肽[5]。Caldeira等從解淀粉芽孢桿菌CCMI 1051分離得到為具有抗真菌活性Iturin及Surfactin[6]。Yu等從解淀粉芽孢桿菌B94分離得到有效成分為3種Iturin A的同分異構(gòu)體[7]。Rao等從解淀粉芽孢桿菌B128分離得到具有抗菌活性Iturin A以及Iturin A的同分異構(gòu)體均為脂肽類物質(zhì)[8]。Chen等從解淀粉芽孢桿菌FZB42分離得到的具抗菌作用物質(zhì)為聚酮化合物[9]。

在果蔬保鮮上的應用方面，解淀粉芽孢桿菌CⅢ-l對于香蕉枯萎病菌 （Fusarium oxysporum f.sp.cubense）具有較好抑制效果；解淀粉芽孢桿菌FZB42產(chǎn)生的聚酮化合物對于由歐文氏菌（Erwinia amylovora）引起的梨火疫病具有防治效果[10]；解淀粉芽孢桿菌K6對于大腸桿菌（Escherichia coli）及藤黃微球菌（Micrococcus luteus）均有著抑制作用；解淀粉芽孢桿菌SYX-l對于黃瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht）有著拮抗作用以及防治效果[11]；解淀粉芽孢桿菌TB2對于辣椒疫霉（Phytophthora capsici）所造成的果疫病防治有極好的效果；解淀粉芽孢桿菌CH-2可抑制油菜核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）菌核的形成及菌絲生長[12]；在肉類保鮮上，時威等在利用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液在保鮮冷卻豬肉方面取得好的效果[13]?？傊畬τ诮獾矸垩挎邨U菌在食品防腐領域的研究日趨廣泛。

從劍門港海區(qū)海底生境采集淤泥樣本，通過稀釋涂布法從中分離篩選獲取具有產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的解淀粉芽孢桿菌純培養(yǎng)并對其作了深入抑菌研究，為開發(fā)出新型食品保鮮抗菌化合物菌株作準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣本實驗樣本采集區(qū)位于浙江省臺州市路橋劍門港海區(qū)（28°1'57''N，121°36'38''E）。

1.1.2 指示菌 （由本實驗室保存）金黃色葡萄球菌（S.aureus）；枯草桿菌（B.subtilis）；大腸桿菌（E.coli）。

1.1.3 實驗儀器及設備回轉(zhuǎn)式恒溫搖床 （HZQX400）、超凈工作臺（ZHJH-C2112C）、立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FB）、pH 計（雷磁 Phb-4）、紫外分光光度計（UV-3000，HITACHI）、水浴鍋（HH-S）、培養(yǎng)箱 （HZQ-F 160A）、冷凍離心機（Centrifuge 5430）、掃描電子顯微鏡（Quanta 200）、光學顯微鏡（NIKON eclipse 50i）、 微量移液器 （Eppendorf）、槍頭、Ep管等。

1.1.4 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基以及平板基礎培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基）：氯化鈉10.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物 5.0 g/L，瓊脂 15.0 g/L，pH 7.2～7.4。

種子液體培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基）：氯化鈉10.0 g/L、胰蛋白胨 10.0 g/L、酵母提取物 5.0 g/L、pH 7.2～7.4。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基Ⅰ：氯化銨1.2 g/L，葡萄糖5.5 g/L，氯化鎂 3.0 g/L，牛肉膏 1.0 g/L，pH 6.8～7.0。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基Ⅱ：酵母膏5.5 g/L，葡萄糖4.0 g/L，（NH4）2SO45g/L，氯化鈉 5 g/L，蛋白胨 7.5 g/L，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基Ⅲ：氯化鈉5 g/L，蔗糖12 g/L，酵母膏 8 g/L，pH 5.8～6.0。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基Ⅳ：氯化鈉5 g/L，葡萄糖1 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 3 g/L，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 淤泥樣本微生物分離在三角燒瓶中加入90 mL生理鹽水及適量的玻璃珠滅菌，然后將10.0 g淤泥樣本加入，在常溫下振蕩均勻20 min，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。按10倍稀釋法用已滅菌的生理鹽水將上述淤泥懸浮液依次稀釋到10-2～10-6倍，吸取范圍在10-4～10-6稀釋倍數(shù)的樣品各0.1 mL到LB培養(yǎng)基平板上分別涂布、倒置，溫度在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后觀察生長情況。無菌條件下挑取單菌落轉(zhuǎn)接在LB固體培養(yǎng)基平板上，連續(xù)操作，直至獲取純培養(yǎng)為止。

1.2.2 產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)微生物的初篩將已經(jīng)篩選獲得的微生物純培養(yǎng)分別使用點接種技術(shù)接種在已涂布有指示菌的固態(tài)LB培養(yǎng)基平板上，37℃條件下倒置培養(yǎng)，24 h后觀察抑菌結(jié)果，利用斜面保存能夠形成抑菌圈的菌株復篩或備用。

1.2.3 具抗菌活性菌株形態(tài)學以及生理生化特征分析研究將篩選獲得具抗菌活性的純培養(yǎng)接種在LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，察看其菌落的生長狀態(tài)。

參照伯杰氏細菌鑒定手冊[14-15]及工業(yè)微生物實驗技術(shù)手冊[16]對具抗菌活性菌株形態(tài)以及生理生化進行實驗。同時在恒溫培養(yǎng)箱察看其在5～50℃（間隔5℃）范圍之間的生長情況。

1.2.4 具抗菌活性菌株 （G+C）mol%含量測定樣品基因組提取純化方法參照文獻[17]，（G+C）mol%含量測定參照高相液相法[18]。

1.2.5 具抗菌活性菌株的分子生物學研究基因組提?。翰捎媒臃N環(huán)在培養(yǎng)皿上刮取小量菌體，純培養(yǎng)總DNA提取方法參考試劑盒說明書使用 （賽百盛基因技術(shù)有限公司，中國）。

采用通用引物以擴增16S rRNA基因。引物提供由 Saibaisheng Gene Co. 合成：5’-ACA AGC CCT GGA AAC GGG GT-3’ 和 5’-CAC CAG GAA TTC CGA TCT’[19]。PCR反應條件是：94℃溫度條件下預變性 4 min，然后進入循環(huán)，在溫度94℃條件下變性50 s，在溫度55℃條件下退火50 s，在溫度72℃條件下延伸2 min，35個循環(huán)后，72℃溫度條件下延伸10 min后4℃條件下保存。利用UltraClean PCR Clean-up kit進行純化PCR產(chǎn)物，之后寄往上海生物工程有限公司進行測序。

系統(tǒng)發(fā)育以及序列分析法[20]采用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）對所得到的菌株Bacillus amyloliquefaciens MBRC1的16S rRNA基因序列進行同源性分析。使用Clustal W（V 1.83）[21]軟件進行多序列BLAST比對，用 BioEdit（V 7.01）進行相關的序列調(diào)整。（Kimura 2-parameter distance calculation）進化樹[22]使用Mega軟件（V 5.1）采用鄰位相連法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建，1000 bootstrap 檢驗[23]。

1.2.6 抑菌菌株復篩及抑菌譜活性實驗該實驗方法使用雙層瓊脂管碟法[24]。

具指示菌雙層瓊脂培養(yǎng)基制備方法：移入20 ml LB瓊脂培養(yǎng)基至每個培養(yǎng)皿，水平凝固以作為基礎底層培養(yǎng)基，取含指示菌懸浮液100 uL加入到已經(jīng)滅菌后溫度降到65℃的100 mL LB固態(tài)培養(yǎng)基后混合均勻，移入5 mL上述培養(yǎng)基至具基礎底層培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上，鋪平后作為含菌上層培養(yǎng)基，冷卻凝固后可倒置備用。

抑菌譜實驗：在冷藏保存斜面試管中挑適量菌體接種至液體種子培養(yǎng)基中，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)16 h，移取2 mL種子培養(yǎng)液到已經(jīng)滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度37℃下培養(yǎng)38 h得到發(fā)酵培養(yǎng)液。上述種子培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)的裝液用量均為20 mL/250 mL搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速均為180 r/min。取以上獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液10 mL在轉(zhuǎn)速12 000 r/min，保持30 min下離心分離，取上清液作為抗菌粗提液。在含具指示菌雙層固體培養(yǎng)基平皿上均勻擺放牛津杯，移入200 uL抗菌粗提液至牛津杯，然后蓋陶瓦蓋。在溫度為37℃條件下培養(yǎng)24 h，抑菌圈直徑使用游標卡尺測量，樣本數(shù)為3，取平均值作為該樣本抑菌直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標微生物的篩選

微生物所的代謝產(chǎn)物可在瓊脂培養(yǎng)基中加以滲透，若這些化合物具有抗菌活性且該抑菌活性物質(zhì)濃度達到一定值后即可抑制指示微生物的生長，在具指示菌的培養(yǎng)皿周圍由于抗菌活性物質(zhì)的作用使微生物不能生長從而出現(xiàn)抑菌圈。此種方法能夠迅速有效地確認微生物所分泌的代謝產(chǎn)物是否具有抗菌活性，已被用于抗菌微生物篩選。本實驗分離獲得多株海洋微生物純培養(yǎng)，以B.Subtili、E.coli及S.aureus作為指示菌利用雙層瓊脂管碟法篩選獲得4株具有抗菌活性的微生物，編號分別為MBRC1，MBRC2，MBRC3，MBRC4，見圖 1。

圖1 具有抑菌功能的菌株在培養(yǎng)基上形成的抑菌圈Fig.1 Formation of inhibition zone on the petri dish

2.2 目標菌的分子生物學研究及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

本實驗室自行設計引物對 MBRC1，MBRC2，MBRC3，MBRC4菌株的基因組進行擴增，回收并純化擴增產(chǎn)物后測序，分別獲得4個片段基因序列，長度分別為 1 030，1 046，1 172 bp 和 1 080 bp。 對于具有抑菌活性較強且有應用潛力的MBRC1進行深層次研究，分子經(jīng)過鑒定并被命名為Bacillus amyloliquefaciensMBRC1，登錄 GenBank并注冊，登錄號是KP247460。采用BLAST將該菌株BacillusamyloliquefaciensMBRC1的16S rRNA基因序列通過同源分析，結(jié)果顯示該菌株為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌，選取與該種菌株同源性接近的相應菌株，利用軟件 BioEdit（V 7.01）和 MEGA（V 5.1）采用鄰位相連法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖 2），從圖 2可以得知，Bacillussp.Q2 16S（JN132107.1），Endophytic bacteriumMD3 （HM1601 61.1）等遺傳距離較為接近。

圖2 基于Bacillus amyloliquefaciens MBRC1 16S rRNA基因序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining tree resulting from analysis of the 16S rRNA gene sequences for Bacillus amyloliquefaciens MBRC1

2.3 Bacillus amyloliquefaciens MBRC1形態(tài)學及生理生化特征研究

從生理生化研究實驗結(jié)果得知，菌株BacillusamyloliquefaciensMBRC1為革蘭氏染色呈陽性；生長溫度在10～45℃之間，28～32℃為該菌株的最適溫度，菌落呈類圓形，該菌株邊緣不規(guī)則，菌落隆起有皺褶，不透明，色呈淺黃且表面較為粗糙，菌落有清晰的輪廓（圖 3），呈桿狀（圖 4）。 （G+C）mol%含量測定結(jié)果為44.2%。

圖3 拮抗菌MBRC1菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology antagonistic of MBRC1

圖4 拮抗菌MBRC1菌絲形態(tài)Fig.4 Hyphae morphology antagonistic of MBRC1

主要生理生化特征由表1可知，菌株MBRC1的對明膠水解、淀粉水解、接觸酶、厭氧生長、V-P反應和硝酸鹽還原呈陽性反應；苯丙氨酸脫氨酶、吲哚產(chǎn)生、檸檬酸鹽、酪氨酸水解利用呈陰性反應；能夠利用蔗糖、D-葡萄糖、D-甘露醇等糖類物質(zhì)。

從觀察可得知，菌株MBRC1在 50℃溫度條件下不生長；在酸度pH值5.6條件下可生長；在鹽度5%NaCl條件下不生長。結(jié)合菌株MBRC1形態(tài)學研究，同時參照文獻[25]，可確認菌株MBRC1是類芽孢桿菌或芽孢桿菌屬。

表1 菌株MBRC1的生理生化特征Table 1 Characteristics of strain MBRC1

2.4 目標菌株的復篩及對指示菌的抑菌效果研究

采用4種發(fā)酵液體培養(yǎng)基分別對MBRC1，MBRC2，MBRC3，MBRC4進行發(fā)酵，離心處理發(fā)酵液獲得上清液，采用瓊脂雙層管碟法復篩出具有能產(chǎn)生抗菌活性微生物菌株。從圖5可知，采用不同發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果顯示 MBRC1，MBRC2，MBRC3，MBRC4均能夠產(chǎn)生較強的對指示菌有抑菌效果的抗菌活性物質(zhì)，其中對3種指示菌均有較為明顯的抑制作用。在不同的培養(yǎng)基中，菌株MBRC1較另外3種菌種顯示出較大的抗菌活性，因此具有潛在的應用前景。

圖5 MBRC1，MBRC2，MBRC3，MBRC4在不同發(fā)酵培養(yǎng)基作用下所得發(fā)酵液對不同指示菌的抑菌作用Fig.5 Antimicrobial activity of the liquid fermentation of MBRC1，MBRC2，MBRC3，MBRC4 against B.subtile,E.coli,S.aureus in the different fermentation mediums

3 討 論

微生物自身在生命過程中由于環(huán)境的影響不斷進行變化，而那些能從環(huán)境得到資源或在代謝中能產(chǎn)生一些能干擾或抑制其他非同類微生物細胞發(fā)育功能的微生物能夠有利于生存及繁殖。目前，已知能夠產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的微生物有以下屬[26-27]：希瓦菌屬（Shewanella）、莫拉菌屬（Moraxella）、小紅卵菌屬（Rhodvulum）、紅細菌屬（Ruegeria）、微球菌屬（Micrococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus） 、著色菌屬（Chromatium）、弧菌屬（Vibrio）、玫瑰桿菌屬（Roseobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、節(jié)桿菌屬（Arthobacter）、短桿菌屬（Brachybacterium）、鹽芽孢桿菌屬（Halobacillus）、擬諾卡菌屬（Nocardiopsis）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、 假單胞菌屬（Pseudomonas）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、交替假單胞菌屬 （Pseudoalteromonas）、交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、交替單胞菌屬（Alteromonas）。這些種屬主要來源于陸生微生物，從目前情況來說，陸地上已較難再發(fā)現(xiàn)新的抗菌化合物，海洋因其具有復雜生態(tài)環(huán)境儲藏著豐富的微生物資源，是新型抗菌活性物質(zhì)的主要來源之一，從海洋生境中發(fā)現(xiàn)抗菌活性物質(zhì)已經(jīng)成為現(xiàn)階段研究熱點。

4 結(jié)語

本實驗從浙東劍門港海區(qū)生境采樣分離篩選獲得產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)較強的微生物為Bacillu屬的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，命名為Bacillus amyloliquefaciensMBRC1。解淀粉芽孢桿菌是普遍生存于自然環(huán)境中的一種非致病性細菌，通過研究可知解淀粉芽孢桿菌在其生長過程中可分泌多種抑菌物質(zhì)，比如通過產(chǎn)生多肽、抗菌蛋白以及抗生素等活性成份來抑制真菌、植物病原菌、線蟲、病毒等，起到了生物防治的效果。并且由于解淀粉芽孢桿菌是非致病性細菌，因此可將其作為一種新型的高效的天然生物防腐劑來開發(fā)，比如可以用在食品防腐等方面應用，從而可更好地服務人類。Bacillus amyloliquefaciensMBRC1篩選及鑒定極大地豐富了抗菌微生物資源，它具有潛在的開發(fā)出新的抗菌化合物的可能，對具體的抑菌物質(zhì)分離及其結(jié)構(gòu)分析鑒定有待于進一步研究。