人參三七川芎提取物對高糖高脂誘導(dǎo)的衰老血管內(nèi)皮細胞自噬的影響

王雪 方靖漪 楊靜 修成奎 雷燕

摘要：目的? 觀察人參三七川芎提取物對血管內(nèi)皮細胞自噬流的影響，探討其延緩高糖高脂誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞衰老的作用機制。方法? 采用40 mmol/L葡萄糖和100 μmol/L棕櫚酸鈉造模，實驗分為空白對照組、衰老模型組和中藥組（200 mg/L），干預(yù)48 h。采用CCK-8檢測細胞增殖能力;β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老程度;Western blot檢測細胞p16、p21、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）和p62蛋白表達;免疫熒光檢測自噬流變化。結(jié)果? 與空白對照組比較，衰老模型組細胞增殖能力和LC3B-Ⅱ表達降低，β-半乳糖苷酶藍染細胞數(shù)量和p16、p21、p62蛋白表達增加，并存在自噬流阻滯;與衰老模型組比較，中藥組細胞增殖能力增強， LC3B-Ⅱ表達升高，β-半乳糖苷酶藍染細胞數(shù)量減少，p16、p21和p62表達降低，自噬流暢通。結(jié)論? 人參三七川芎提取物可延緩高糖高脂引起的血管內(nèi)皮細胞衰老，其機制可能與增強細胞自噬活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：人參三七川芎提取物;血管內(nèi)皮細胞;細胞衰老;自噬

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2019）04-0052-05

2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）目前已成為嚴重威脅人類健康的疾病之一[1]，其中大血管并發(fā)癥在其各種并發(fā)癥中約占75%，是T2DM患者致殘致死的主要原因[2]。研究表明，血管內(nèi)皮功能紊亂是T2DM大血管并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，而血管內(nèi)皮細胞衰老在內(nèi)皮功能紊亂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。細胞自噬是一種不同于細胞凋亡的程序性死亡，可將細胞內(nèi)受損細胞器、生物大分子等結(jié)構(gòu)通過溶酶體降解，實現(xiàn)自我保護及維持穩(wěn)態(tài)，自噬缺陷與癌癥、神經(jīng)退行性變、炎癥和代謝性疾病密切相關(guān)[5]。機體衰老過程中自噬活性逐漸衰減，在復(fù)制性和誘導(dǎo)性衰老的細胞中，通過不同途徑適當上調(diào)自噬具有一定延緩細胞衰老的作用[6-8]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血中藥人參、三七、川芎能調(diào)節(jié)復(fù)制性衰老的微血管內(nèi)皮細胞的自噬水平[9]，但在高糖高脂誘導(dǎo)的衰老大血管內(nèi)皮細胞中是否也有同樣的調(diào)節(jié)作用，目前尚未見報道。因此，本研究以高糖高脂誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細胞衰老為模型，觀察人參三七川芎提取物對細胞自噬的干預(yù)作用，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1? 實驗材料

1.1? 藥物

人參、三七、川芎合劑凍干粉，北京因科瑞斯醫(yī)藥科技公司制備提供。藥物為道地藥材，人參產(chǎn)自吉林，三七產(chǎn)自云南，川芎產(chǎn)自四川，按2∶3∶4比例破碎成粗粉，乙醇回收提取，過濾后棄藥渣，醇提液回收至無醇味濃縮液，繼續(xù)濃縮至稠膏狀，再經(jīng)干燥至干膏，最終每1 g凍干粉相當于原藥材4.286 g，使用時以DPBS配制成10 g/L的貯存液，以0.22 μm濾器過濾分裝，置于-20 ℃冰箱保存。依據(jù)藥典對人參三七川芎提取物中指標性成分阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1進行HPLC分析[10]。

1.2? 細胞

人主動脈內(nèi)皮細胞（HAEC），美國Sciencell公司，并提供細胞鑒定書。

1.3? 試劑

內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、內(nèi)皮細胞生長因子、青霉素/鏈霉素溶液、胰酶消化液、細胞凍存液，美國Sciencell公司，批號分別為1001、0025、1052、0503、

0103、0133;CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所，批號LG615;細胞衰老β-半乳糖苷酶檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0602;p21兔單克隆抗體，p16兔單克隆抗體，LC3B兔單克隆抗體、p62小鼠單克隆抗體，英國Abcam公司，批號分別為ab109199、ab51243、ab192890、ab56416;辣根酶標記山羊抗兔/山羊抗小鼠IgG（H+L），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZB-2301、ZB-2305;巴弗羅霉素，美國MCE公司，批號88899-55-2;自噬腺病毒載體系統(tǒng)Ad-mRFP- GFP-LC3，漢恒生物科技（上海）有限公司;D-葡萄糖、棕櫚酸鈉美國Sigma公司，批號分別為SLBR0902V、SLBV2022;無脂肪酸BSA（d-BSA），北京索萊寶公司，批號1206F052。棕櫚酸鈉溶于PBS（95 ℃助溶）配成20 mmol/L溶液，將d-BSA按質(zhì)量/體積溶于DPBS（55 ℃助溶）配成20%d-BSA溶液，將棕櫚酸鈉趁熱加入到等體積的d-BSA中，配成10 mmol/L棕櫚酸鈉（含10%d-BSA）貯存液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? 儀器

AE2000型倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)（中國麥克奧迪實業(yè)集團有限公司），F(xiàn)orma 370型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Synergy H1型全自動酶標儀（美國Bio Tek公司），F(xiàn)V1000型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），Mini-PROTEAN Tetra Cell型電泳槽系統(tǒng)，PowerPac universal power supply型通用電泳儀電源，Trans-blot sp cell型半干轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司）。

2? 實驗方法

2.1? 細胞培養(yǎng)

HAECs培養(yǎng)于含5%胎牛血清、內(nèi)皮生長因子、青霉素（100 U/L）/鏈霉素（100 mg/L）的完全培養(yǎng)基，于飽和5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，至細胞密度為80%～90%，按照1∶2或1∶3傳代培養(yǎng)。根據(jù)前期實驗結(jié)果，本實驗采用40 mmol/L D-葡萄糖聯(lián)合100 μmol/L棕櫚酸鈉誘導(dǎo)HAEC細胞衰老[11]。實驗分為空白對照組、葡萄糖/棕櫚酸誘導(dǎo)的衰老模型組和人參三七川芎提取物干預(yù)的中藥組。

2.2? CCK-8檢測細胞增殖活力

細胞5×103個/孔接種于96孔板，每組設(shè)立6個復(fù)孔，待細胞貼壁后，每組進行相應(yīng)的處理，藥物作用指定時間后，將孔板中原液體吸出，向每孔內(nèi)加入用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋成含10%CCK-8試劑液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2～3 h，于酶標儀450 nm波長處檢測吸光值。

2.3? 細胞衰老β-半乳糖苷酶染色

待測細胞以2×104個/孔接種于24孔板中，細胞貼壁后，吸除細胞培養(yǎng)液，DPBS洗滌1次，每孔加250 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，吸除細胞固定液，DPBS洗滌細胞3次，每孔加250 μL染色工作液，置于無CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)，計算藍染細胞數(shù)量占視野內(nèi)總細胞量的比例。

2.4? Ad-mRFP-GFP-LC3檢測自噬流

將狀態(tài)良好的HAECs接種于激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，貼壁24 h后取Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒（病毒滴度為1×107 PFU/mL）在冰上溶解，使用完全培養(yǎng)基按感染復(fù)數(shù)（MOI）=300稀釋，處理4 h后換成新鮮完全培養(yǎng)基，置于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)過夜。根據(jù)實驗分組干預(yù)48 h后置于熒光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)自噬體的形成情況[12]。

2.5? Western blot檢測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ、p16、p21及p62蛋白表達

按RIPA蛋白抽提試劑說明提取各組總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白含量后調(diào)整蛋白濃度，加5×loading buffer，99 ℃變性10 min;8%～12%SDS- PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶2000稀釋一抗，4 ℃過夜;TBST清洗3次×5 min，1∶3000稀釋二抗后室溫孵育1 h;TBST清洗3次×5 min，ECL顯示目的條帶。采用Image Lab圖像分析系統(tǒng)對條帶灰度值進行分析，并以β-actin為內(nèi)參照。

3? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，多組樣本采用方差分析，若方差齊用LSD法進行兩兩比較;若方差不齊則用Dunnett's法分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 人參三七川芎提取物中主要成分含量

經(jīng)HPLC檢測，人參三七川芎提取物中5種主要成分含量見表1。

4.2? 人參三七川芎提取物對細胞增殖能力的影響

與空白對照組比較，高糖高脂干預(yù)48 h可明顯抑制HAECs的增殖;與衰老模型組比較，25～200 mg/L人參三七川芎提取物可明顯促進細胞的增殖能力，并呈濃度依賴性。但隨著提取物濃度的進一步增加，細胞的增殖能力下降，其中800、1000 mg/L劑量組對細胞有明顯的抑制作用。由此確定中藥最佳干預(yù)劑量為200 mg/L，后續(xù)中藥組濃度選用該劑量進行實驗。結(jié)果見圖1。

4.3? 人參三七川芎提取物對細胞衰老β-半乳糖苷酶染色的影響

衰老模型組β-半乳糖苷酶藍染比例較空白對照組明顯增加（P<0.05）;200 mg/L人參三七川芎提取物處理后β-半乳糖苷酶藍染陽性比例明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見圖2、表2。

空白對照組 衰老模型組 中藥組

4.4? 人參三七川芎提取物對細胞衰老相關(guān)蛋白p16、p21的影響

與空白對照組比較，衰老模型組HAECs p16、p21蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與衰老模型組比較，中藥組HAECs p16、p21蛋白表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖3。

4.5? 人參三七川芎提取物對自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ、p62的影響

與空白對照組比較，衰老模型組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達降低，p62表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與衰老模型組比較，中藥組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達明顯升高，p62顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖4。

4.6? 人參三七川芎提取物對細胞自噬流的影響

將感染mRFP-GFP-LC3雙熒光標記腺病毒細胞進行分組刺激，mRFP（紅色熒光）用于標記及追蹤LC3蛋白，溶酶體內(nèi)部環(huán)境為酸性，當自噬小體與溶酶體融合，對酸性環(huán)境敏感的GFP（綠色熒光）淬滅。因此，紅綠熒光Merge后，GFP+RFP+為黃色斑點，即為自噬體，GFP-RFP+為紅色斑點，即自噬溶酶體，紅/黃色斑點數(shù)目多少，可清晰判斷出自噬流的強弱及自噬流通暢與否。與空白對照組比較，衰老模型組黃斑點和紅斑點數(shù)量均減少，表明自噬雖增強，而自噬流不通暢;與衰老模型組比較，人參三七川芎提取物干預(yù)均可明顯增加黃、紅斑點的數(shù)量，尤其是紅色斑點，表明自噬流通暢。結(jié)果見圖5。

5? 討論

自噬是細胞內(nèi)一種“自食”現(xiàn)象，細胞利用溶酶體降解自身受損蛋白質(zhì)、衰老或損傷的細胞器等細胞結(jié)構(gòu)，從而保證細胞能量代謝和新舊細胞器更迭的順利進行[13]。自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達能敏感反映自噬狀態(tài)，當自噬小體形成時，胞漿型蛋白LC3Ⅰ經(jīng)酶解轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ，并被募集定位在自噬體膜上，其水平在一定程度上反映了自噬體數(shù)量和自噬程度。自噬標記蛋白p62是多泛素化結(jié)合蛋白，自噬發(fā)生時p62作為自噬底物蛋白，參與自噬的過程并在自噬溶酶體中降解，因此，p62蛋白水平與自噬活性成反比，可反映自噬反應(yīng)的強弱[14]。

細胞自噬與細胞衰老關(guān)系密切。在衰老過程中，細胞可通過啟動自噬，清除受損的生物大分子和功能異常的線粒體等，避免損傷的累積，維持細胞形態(tài)正常和功能的穩(wěn)定，延長細胞壽命[15-16]。但糖尿病患者長期處于糖脂代謝紊亂狀態(tài)，高糖和高脂環(huán)境通過抑制ULK1磷酸化、自噬小體形成和溶酶體降解等環(huán)節(jié)，下調(diào)血管內(nèi)皮細胞自噬水平[17-18]，這可能是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞進入衰老期，造成血管內(nèi)皮完整性喪失和功能紊亂，促進血管并發(fā)癥形成的機制之一[19-20]。

中醫(yī)理論認為，氣血是構(gòu)成人體的最基本物質(zhì)，“以奉生身，莫貴于此”，是臟腑經(jīng)絡(luò)等組織器官進行生理活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，而氣虛血瘀是人體衰老的主要病機。人參、三七、川芎三藥聯(lián)用有益氣活血、通脈活絡(luò)、延年益壽的功效。本研究采用人參三七川芎提取物干預(yù)高糖高脂處理的HAEC后，發(fā)現(xiàn)人參三七川芎提取物可促進細胞增殖，減少β-半乳糖苷酶藍染細胞數(shù)量，并降低p16和p21表達水平，表明人參三七川芎提取物能有效延緩高糖高脂誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老。

進一步對細胞自噬機制研究發(fā)現(xiàn)，中藥組既可增加LC3B-Ⅱ表達，也可降低p62水平，表明人參三七川芎提取物能增強衰老內(nèi)皮細胞的自噬活性，誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生。自噬是一個細胞內(nèi)的動態(tài)過程，即“自噬流”，細胞內(nèi)自噬體的增加既可能由于自噬小體形成的增加，也可能由于自噬小體降解的減少[21]。為明確人參三七川芎提取物作用于整個“自噬流”的環(huán)節(jié)，本研究利用mRFP-GFP-LC3雙熒光標記腺病毒作為研究工具，發(fā)現(xiàn)在高糖高脂誘導(dǎo)的衰老細胞中，自噬流阻滯于下游自噬溶酶體的降解，表明其自噬活性的增強源于自噬流不通暢;而人參三七川芎提取物干預(yù)可明顯增加黃、紅斑點的數(shù)量，尤其是紅色斑點，表明可促進自噬流通暢，中藥組自噬活性增強是通過促進自噬小體的形成階段從而促進整個細胞“自噬流”的順利進行。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)人參三七川芎提取物能通過調(diào)節(jié)細胞自噬延緩高糖高脂引起的血管內(nèi)皮細胞衰老，可為減少糖尿病大血管并發(fā)癥提供一定的借鑒和參考。然而，人參三七川芎提取物通過哪些具體分子信號通路增強自噬而延緩細胞衰老、其間內(nèi)在聯(lián)系是什么、如何保證自噬的平衡狀態(tài)既可誘導(dǎo)又不至于過度等，這些問題在本研究中尚未涉及，需要今后進一步深入研究。

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（收稿日期：2018-10-28）

（修回日期：2019-02-14;編輯：華強）