基于網絡藥理學的虎杖治療結直腸癌作用機制研究

嚴卿瑩 葉曄 馮冠 郭凱波 阮善明 沈敏鶴

摘要：目的? 基于網絡藥理學方法分析虎杖治療結直腸癌的藥理機制，為新藥研發(fā)提供參考。方法? 通過TTD、Dis數(shù)據(jù)庫提取結直腸癌的主要靶點，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中提取虎杖的主要化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30、藥物半衰期（HL）≥4 h、類藥性（DL）≥0.18篩選活性成分，通過HIT、ChemMapper、STITCH數(shù)據(jù)庫提取活性成分主要靶點，采用Cytoscape3.2.1軟件構建成分-靶點網絡，并分析主要通路。結果? 經篩選，共獲得9種主要活性成分，作用于56個靶點，其中核心靶點有ESR1、KRAS、TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A等，主要作用于調控生長因子及其受體信號通路、白細胞介素介導的信號通路、細胞凋亡及生物氧化等多種信號通路。結論? 本研究初步揭示了虎杖治療結直腸癌的多成分、多靶點、多通路的作用機制，可為虎杖開發(fā)利用提供參考。

關鍵詞：網絡藥理學;虎杖;結直腸癌;活性成分

中圖分類號：R285;R273.53? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2019）04-0096-05

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著飲食結構及生活習慣的改變，我國結直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢，在惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率均分別居第4位和第5位[1]。

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc.的干燥根莖，性微寒，味微苦，有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛功效，其化學成分主要有蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類等?；⒄染哂锌寡住⒖共《?、抗菌、調血脂、抗血栓、改變血流變、擴張血管、抗氧化、抗腫瘤等作用[2]。研究表明，虎杖及其主要化學成分白藜蘆醇在結直腸癌的治療中發(fā)揮重要作用[3]。復方研究中，白藜蘆醇含量高的虎杖發(fā)揮著主導作用[4]。柏連松臨床治療結直腸癌以虎杖作為常用藥，療效顯著[5]?；⒄瘸煞州^多，抗結直腸癌的主要機制尚未明確。本研究主要篩選結直腸癌的潛在治療靶點，通過網絡藥理學方法對虎杖的主要活性成分進行篩選，分析活性成分的作用靶點及生物通路，從而闡明虎杖治療結直腸癌可能的作用機制。

1? 資料與方法

1.1? 結直腸癌靶點預測

以“colorectal cancer”為關鍵詞，挖掘TTD數(shù)據(jù)庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）及Dis數(shù)據(jù)庫（http：// www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）中治療結直腸癌的潛在靶點。在Dis數(shù)據(jù)庫中，得分越高，表明該靶點與疾病的相關性越高。設定得分>0.01的目標靶點為結直腸癌的潛在靶點。刪除2個數(shù)據(jù)庫間的重復靶點。為標準化靶點基因信息，將不同ID類型轉換為Swiss-Prot號。

1.2? 化學成分收集與活性成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp. php）查找虎杖相關的分子信息及相應的生物學測試，在此基礎上以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物半衰期（half-life，HL）≥4 h、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為活性成分篩選條件。

1.3? 目標靶點收集

已驗證的靶點從HIT數(shù)據(jù)庫（http：//lifecenter.sgst. cn/hit/）中提取，根據(jù)Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem. ncbi.nlm.nih.gov）中各活性成分的分子結構圖，從ChemMapper（http：//lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/）、STITCH數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de/）中獲得潛在的預測靶點。ChemMapper在線工具基于3D相似性預測靶點，本研究設定各活性成分的靶點預測參數(shù)為分子的3D相似性>0.85，且均來源于DrugBank數(shù)據(jù)庫。

1.4? 網絡構建與分析

使用Cytoscape3.2.1軟件構建成分-靶點網絡。使用插件CentiScape分析網絡以計算拓撲參數(shù)，包括自由度、介數(shù)。自由度越大，參與的生物功能越多，生物學重要性越強;介數(shù)越大，表明節(jié)點在網絡中越重要。

1.5? 通路分析

通過Cytoscape插件，Reactome FI軟件進一步分析虎杖治療結直腸癌預測靶點的相關通路。將相關靶點導入Reactome FI，設定P≤0.01，錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.01進行通路分析。

2? 結果

2.1? 結直腸癌相關靶點基因

從TTD數(shù)據(jù)庫共獲得31個靶點基因，從Dis數(shù)據(jù)庫中獲得2753個潛在靶點基因（其中得分>0.01的有124個靶點），刪除重復基因，共獲得150個可能與結直腸癌相關的靶點基因。

2.2? 虎杖化學成分及目標靶點

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中提取虎杖化學成分63種，經篩選，獲得9種主要活性成分：木犀草素、槲皮素、β-谷甾醇、大黃素甲醚苷、大黃酸、Torachrysone- 8-O-beta-D-（6'-oxayl）-glucoside、6，8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone、囊毒堿及鴨腳樹葉堿，見表1。

2.3? 活性成分驗證靶點及預測靶點

各活性成分的目標靶點見表2。其中HZ-1包含56個已驗證靶點和357個預測靶點，HZ-2包含167個已驗證靶點和564個預測靶點，HZ-3包含10個已驗證靶點和1018個預測靶點。

2.4? 活性成分-靶點網絡分析及主要活性成分

構建9種活性成分成分-靶點網絡，該網絡由65個節(jié)點構成，包括9個成分節(jié)點和56個目標靶點，見圖1。

網絡分析表明，β-谷甾醇自由度為36，介數(shù)為0.435 28，預測為虎杖治療腫瘤中發(fā)揮的主要成分，其次為木犀草素（自由度為31、介數(shù)為0.435 28）、大黃酸（自由度為22、介數(shù)為0.108 20），見表3。

ESR1為9種活性成分共有的目標靶點，因此我們認為ESR1是虎杖治療結直腸癌的最主要靶點，KRAS、TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A亦為相對重要靶點，見表4。

2.5? 基因功能及通路分析

應用Reactome FI對虎杖治療結直腸癌相關靶點進行信號通路分析，根據(jù)設定，共富集到38條信號通路。相關靶點主要富集于免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號、通用轉錄途徑、白細胞介素介導的信號通路、PI3K/AKT信號通路、B細胞受體介導的信號通路、EGFR信號通路、ERBB信號通路、TP53信號通路，同時與細胞凋亡、生物氧化、調節(jié)胰島素樣生長因子、P21的轉錄激活等密切相關，見表5。

3? 討論

結直腸癌屬中醫(yī)學“癥瘕”“腸蕈”“積聚”等范疇，起病較為隱匿。目前化療仍為大部分轉移性結直腸癌的首選，盡管靶向藥物在一定程度上提高了客觀緩解率和總生存率，但多藥耐藥及不良反應影響了療效及患者生存質量。因此，中醫(yī)藥干預結直腸癌相關研究越來越受到重視。

本研究通過網絡藥理學方法初步篩選出虎杖治療結直腸癌的活性成分為β-谷甾醇、木犀草素和大黃酸。β-谷甾醇是存在于植物和蔬菜中的主要生物活性成分，可清除活性氧誘導結直腸癌細胞凋亡，發(fā)揮抗氧化性，從而抑制結直腸癌的發(fā)生發(fā)展[6]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，可抑制CREB1的轉錄，從而阻斷上皮間質轉化，發(fā)揮抗結直腸癌的作用[7]。大黃酸作為虎杖的重要成分，能逆轉卵巢癌中阿霉素多藥耐藥[8]，還可減輕惡病質[9]。因此，虎杖治療結直腸癌主要通過β-谷甾醇、木犀草素和大黃酸發(fā)揮作用。

ESR1是結直腸癌發(fā)生、進展和轉移中最重要的調節(jié)基因[10]，同時KRAS、TP53等可能在結直腸癌診斷中起關鍵作用[11]。KRAS突變、p53缺失可能是結腸癌轉移的潛在生物標志物[12]。本研究結果表明，虎杖治療結直腸癌的靶點主要集中在ERS1，而KRAS亦為重要靶點之一，盡管目前EGFR抗體對RAS野生型結直腸癌顯示出較好的療效，但不能使KRAS突變型患者獲益[13]，故以虎杖為主藥的中藥制劑及復方可能在一定程度上提高KRAS突變患者的療效。

虎杖主要成分大黃酸可通過MAPK、PI3K/AKT、ERK等多條信號通路發(fā)揮抑制腫瘤細胞活化、增殖、侵襲和遷移的作用[14]。本研究結果顯示，虎杖治療結直腸癌的相關靶點主要富集于調控生長因子及其受體，包括EGFR信號通路、ERBB信號通路、PI3K/AKT信號通路、TP53信號通路。通過對活性成分的靶點預測，篩選出虎杖治療結直腸癌的主要靶點還有TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A等基因，表明虎杖可通過多靶點、多通路發(fā)揮治療結直腸癌的作用。

本研究初步探討了虎杖治療結直腸癌的藥理機制，但虎杖活性成分較多，在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用的許多成分如白藜蘆醇因OB、HL及DL未達到要求，未進一步分析。因此，本研究結果仍需要進一步實驗驗證。

參考文獻：

[1] CHEN W， ZHENG R， BAADE P D， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]. CA：A Cancer Journal for Clinicians，2016，66（2）：115- 132.

[2] 時圣明，潘明佳，王文倩，等.虎杖的化學成分及藥理作用研究進展[J].藥物評價研究，2016，39（2）：313-317.

[3] 何蕾，倪敏，樊志敏.虎杖提取物白藜蘆醇抗腫瘤機制的研究進展[J].中醫(yī)藥導報，2017，23（8）：40-43.

[4] 阮善明，繆昊均，嚴卿瑩，等.解毒三根湯調節(jié)腫瘤相關成纖維細胞Sirt1-NF-κB途徑抗結腸癌侵襲轉移[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015， 30（9）：3082-3086.

[5] 王昱，柏連松.柏連松教授臨床用藥經驗舉隅[J].中醫(yī)藥導報，2017， 23（16）：41-45.

[6] BASKAR A A， IGNACIMUTHU S， PAULRAJ G M， et al. Chemopreventive potential of beta-sitosterol in experimental colon cancer model-an in vitro and in vivo study[J]. BMC Complement Altern Med，2010，10（1）：24.

[7] LIU Y， LANG T， JIN B， et al. Luteolin inhibits colorectal cancer cell epithelial-to-mesenchymal transition by suppressing CREB1 expression revealed by comparative proteomics study[J]. J Proteomics，2017，161：1-10.

[8] HAN N N， LI X， TAO L， et al. Doxorubicin and rhein loaded nanomicelles attenuates multidrug resistance in human ovarian cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun，2018，498（1）：178-185.

[9] HU L， CUI R， LIU H， et al. Emodin and rhein decrease levels of hypoxia-inducible factor-1α in human pancreatic cancer cells and attenuate cancer cachexia in athymic mice carrying these cells[J]. Oncotarget，2017，8（50）：88008-88020.

[10] ASGHARI M， ABAZARI M F， BOKHARAEI H， et al. Key genes and regulatory networks involved in the initiation， progression and invasion of colorectal cancer[J]. Future Sci OA，2018，4（3）：FSO278.

[11] 鄭燕芳，李紀強，姜茂竹，等.結直腸癌診斷相關基因的文獻計量學與生物信息學分析[J].中國老年學雜志，2015，35（4）：968-970.

[12] HUANG D， SUN W， ZHOU Y， et al. Mutations of key driver genes in colorectal cancer progression and metastasis[J]. Cancer Metastasis Rev，2018，37（1）：173-187.

[13] OKI E， ANDO K， NAKANISHI R， et al. Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis[J]. Ann Gastroenterol Surg，2018， 2（3）：167-175.

[14] WU C， CAO H， ZHOU H， et al. Research progress on the antitumor effects of rhein：literature review[J]. Anticancer Agents Med Chem，2017，17（12）：1624-1632.

（收稿日期：2018-07-28）

（修回日期：2018-08-16;編輯：向宇雁）