陶 虎，何 雷，熊 琪，張 年，劉 洋，陳明新*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070)

【研究意義】動物組織中存在各種RNA，包括信使RNA、核糖體RNA、非編碼RNA等，它們結(jié)構(gòu)不同，功能各異，但都在生命活動中發(fā)揮重要作用。【前人研究進展】環(huán)狀RNA(Circular RNA, circRNA)是一類新型的內(nèi)源性非編碼RNA，具有環(huán)狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和組織表達特異性等特性。目前山羊卵泡circRNA的研究還處于初始階段，研究其調(diào)控山羊卵泡發(fā)育的調(diào)控作用，可以進一步闡明circRNA的功能和機制，為家畜育種提供理論基礎(chǔ)和新見解。CircRNA是在mRNA前體剪切過程中，外顯子和(或)內(nèi)含子的5’端與3’端以反向剪切(Back Splicing)形式連接，最終形成共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[1-2]。circRNA廣泛存在于真核細胞內(nèi)，具有物種保守性、組織特異性和穩(wěn)定性等特性[3]。主要通過3種機制發(fā)揮調(diào)控作用：①CircRNA作為miRNA海綿調(diào)控基因的表達；②CircRNA結(jié)合RNA結(jié)合蛋白(RBP)形成RNA-蛋白復(fù)合物，調(diào)控線性親本基因的轉(zhuǎn)錄[4]；③CircRNA可以編碼蛋白質(zhì)，發(fā)揮生物學(xué)功能[5-6]。CircRNA調(diào)控卵泡發(fā)育的研究較為有限。Capel等人在小鼠精子決定基因SRY中發(fā)現(xiàn)了circRNA[7]，并且SRY也被證實可以吸附miR-138，發(fā)揮“miRNA海綿”作用[8]?！颈狙芯壳腥朦c】繼miRNA和lncRNA后，circRNA已成為非編碼RNA研究領(lǐng)域的新熱點。近年來對于circRNA的研究日益增多，但是對circ_ZCCHC24在山羊卵泡中的作用機制還未見詳細研究?！緮M解決的科學(xué)問題】本研究以高低繁殖力山羊排卵前卵泡中差異表達的circ_ ZCCHC24為研究對象。對circ_ ZCCHC24是否正確成環(huán)進行鑒定，分析它的組織表達特異性，為揭示circ_ ZCCHC24的遺傳調(diào)控機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

山羊組織(腎、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺)樣品采集自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種羊場和湖北波爾山羊保種場，山羊選擇18月齡的成年母羊；屠宰后10 min內(nèi)采集腎、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺組織各3份，經(jīng)PBS清洗后放入去RNA酶的樣品采集管內(nèi)，置于液氮帶回實驗室進行總RNA的提取，剩余樣本放置在-80℃冰箱保存。

1.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

利用天根RNA simple總RNA提取試劑盒來山羊不同組織樣品中總RNA的提取，操作按照試劑盒說明書進行，使用NanoDrop 2000型DNA/RNA濃度測定儀，測定DNA濃度和OD值，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。采用Takara的PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA模板。操作按照試劑盒說明書進行，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生物信息學(xué)分析

采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了波爾山羊和麻城黑山羊排卵前卵泡組織中的circRNA，利用生物信息學(xué)手段分析轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得山羊circ_ZCCHC24的全長序列、接頭序列和形成結(jié)構(gòu)。

1.4 引物設(shè)計

以circ_ZCCHC24的全長序列為模板，利用Primer 5軟件設(shè)計鑒定山羊circ_ZCCHC24的引物，預(yù)期擴增片斷長度為78 bp，相關(guān)引物信息詳見表1，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.5 PCR擴增

PCR反應(yīng)總體系50 μl，其中山羊cDNA模板2 μl，I-5TM2×High Fidelity Master Mix試劑 25 μl，上、下游引物(0.4 μM)各2 μl，去離子水加至50 μl。PCR擴增程序為98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，16 ℃保存。PCR儀為Mini CyclerTM基因擴增儀，PCR擴增產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，具體操作按產(chǎn)品說明書進行。

1.6 目的片段測序驗證

將PCR產(chǎn)物膠回收產(chǎn)物連接pMD18-T 線性載體質(zhì)粒，連接反應(yīng)體系：8 μl純化后的PCR產(chǎn)物，10×Ligation Buffer 1 μl，pMD18-T質(zhì)粒1 μl，反應(yīng)體系于16 ℃金屬浴條件下連接1 h。隨后加入50 mL DH5α感受態(tài)細胞，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)箱中過夜，陽性菌液送北京奧科生物科技公司測序。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

qRT-PCR反應(yīng)總體系20 μl，其中山羊不同組織cDNA模板各1 μl，SYBR?Green Supermix 10 μl，上、下游引物(0.4 μM)各0.25 μl，去離子水加至20 μl。PCR擴增程序為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)；72℃延伸45 s。儀器采用Mini CyclerTM基因擴增儀，利用2-ΔΔCT方法進行分析。

1.8 熒光原位雜交(FISH)

將麻城黑山羊卵泡組織放入固定液中固定6 h，經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟包埋，石蠟經(jīng)切片機切片，62 ℃烤片2 h；切片于修復(fù)液中煮沸15 min，滴加蛋白酶K(20 μg/mL)37 ℃消化30 min；滴加預(yù)雜交液，37 ℃孵育1 h；滴加含探針circ_ZCCHC24-Probe的雜交液(8 ng/μl)，37 ℃雜交過夜后進行洗滌，探針序列詳見表1；切片滴加DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)染液，避光孵育8 min，沖洗后滴加抗熒光淬滅劑封片；處理后的切片利用尼康ECLIPSE CI正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

表1 引物與探針信息

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊circRNA circ_ZCCHC24的生物信息學(xué)分析

前期利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了繁殖力顯著差異的波爾山羊和麻城黑山羊排卵前卵泡組織中的circRNA，篩選出circ_ZCCHC24在2個山羊品種中的表達存在顯著差異。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得出circ_ZCCHC24堿基全長為2045 bp(圖1A)，接頭序列信息如圖1B所示。將測序所得circ_ZCCHC24的序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行檢索，circ_ZCCHC24的全長序列是由山羊ZCCHC24基因(GenBank登錄號：NC_030835.1)的部分第1內(nèi)含子和全部第2外顯子堿基序列環(huán)化而成(圖1C)。表明circ_ZCCHC24是由外顯子和內(nèi)含子共同組成的circRNA。

圖1 山羊circ_ZCCHC24序列信息(A)、接頭序列信息(B)及結(jié)構(gòu)示意圖(C)Fig.1 Information of goat circ_ZCCHC24 sequence (A), junction sequence (B) and schematic of goat circRNA circ_ZCCHC24 (C)

圖2 利用分散引物檢測circRNA的示意圖(A)，分散引物擴增的circ_ZCCHC24 PCR產(chǎn)物電泳圖(B)及采用分散引物PCR擴增circ_ZCCHC24接頭序列的測序結(jié)果(C)Fig.2 Schematic representation of the detection circRNAs using divergent primer (A), electrophoretogram of the circ_ZCCHC24 PCR products obtained with divergent primers (B), sanger sequencing of circ_ZCCHC24 PCR products resulting from amplification using divergent primers confirms head-to-tail splicing (C)

圖3 山羊circ_ZCCHC24在不同山羊品種中的表達水平(A)及在波爾母羊不同組織中的表達水平(B)Fig.3 Expression level of circ_ZCCHC24 in two different goat breeds (A) and seven tissues of Boer ewes (B)

2.2 山羊circRNA circ_ZCCHC24的鑒定

為了確定山羊circRNA circ_ZCCHC24是否正確成環(huán)，設(shè)計了分散引物(Divergent Primer)用于擴增circ_ZCCHC24的接頭序列，從而進行成環(huán)鑒定(圖2A)。利用分散引物的PCR擴增獲得了circ_ZCCHC24接頭序列產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳結(jié)果顯示circ_ZCCHC24的接頭序列順利擴增，擴增產(chǎn)物長度為78 bp(圖2B)，再利用Sanger測序進一步證實了接頭序列中存在環(huán)化位點(圖2C)。上述結(jié)果表明circ_ZCCHC24在山羊卵泡組織中能夠正確成環(huán)。

2.3 山羊circRNA circ_ZCCHC24的表達模式分析

通過qRT-PCR分析了circ_ZCCHC24在2個山羊品種中的表達水平，發(fā)現(xiàn)circ_ZCCHC24在麻城黑山羊中的表達量遠高于波爾山羊(P≤0.01，圖3A)。此外，研究了circ_ZCCHC24在波爾母羊腎、心、肌肉、肝、脾和卵泡等不同組織中的相對表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circ_ZCCHC24在上述6種組織中均有表達，其中在腎中表達量最高，卵泡中表達量最低(圖3B)。表明circ_ZCCHC24的表達水平具有組織特異性。

2.4 山羊circRNA circ_ZCCHC24的細胞定位

為了檢測山羊circ_ZCCHC24在山羊卵泡顆粒細胞中的細胞定位情況，針對接頭序列設(shè)計了CY3標記的探針，利用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)進行了細胞定位分析，結(jié)果顯示，circ_ZCCHC24定位于山羊卵泡顆粒細胞的胞質(zhì)中(圖4)。表明circ_ZCCHC24可能發(fā)揮作用的形式是通過吸附miRNA來完成的。

3 討 論

哺乳動物卵泡的產(chǎn)生是一種由原始卵泡發(fā)育成排卵前卵泡的連續(xù)復(fù)雜過程[9]。其中，卵泡顆粒細胞在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，為卵母細胞提供必需的生長因子和特定蛋白質(zhì)，卵泡顆粒細胞的增殖可誘導(dǎo)卵泡的生長和卵母細胞的成熟[10]。卵泡發(fā)生的復(fù)雜性表現(xiàn)在卵母細胞的發(fā)育需要眾多基因組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮作用[11]。然而，動物卵泡發(fā)育和顆粒細胞增殖的決定性調(diào)控機制仍需要進一步研究。

長久以來，非編碼RNA被認為是一種轉(zhuǎn)錄垃圾，不發(fā)揮任何作用。然而越來越多的研究表明，包括miRNAs、circRNAs、piRNA和lncRNA等在各種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能[1, 12-14]。尤其circRNA更是成為現(xiàn)在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點，因此，我們以高低繁殖力山羊排卵前卵泡中差異表達的circRNA circ_ ZCCHC24為主要研究對象，對其進行成環(huán)鑒定，分析其結(jié)構(gòu)和表達分布情況。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)circ_ ZCCHC24由山羊ZCCHC24基因的部分第1內(nèi)含子和第2外顯子環(huán)化而成。circRNA的成環(huán)來源類型分類，包括外顯子來源的circ RNA、內(nèi)含子來源的circRNA和外顯子和內(nèi)含子共同組成的circ RNA[15]。本研究證實的由部分內(nèi)含子和完整外顯子組成的circ_ ZCCHC24，則可能是一種新的circRNA來源類型。利用sanger測序技術(shù)明確了circ_ ZCCHC24的接頭序列，從而證明circ_ ZCCHC24是真正的circRNA。利用測序技術(shù)明確接頭序列是檢驗circRNA是否正確成環(huán)的金標準[1]。分析了circ_ ZCCHC24的表達模式，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的組織特異性，其中在波爾山羊的腎臟中表達最高，在脾和卵泡中表達最低，由于circ_ ZCCHC24本身實在波爾山羊卵泡中低表達，因此上述表達模式結(jié)果符合預(yù)期。

CircRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)控作用，CircRNA在細胞核內(nèi)調(diào)控來源基因(Host gene)的表達[16]，在細胞質(zhì)內(nèi)則發(fā)揮內(nèi)源性競爭RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)的作用[17]。為了檢測circ_ZCCHC24在山羊卵泡顆粒細胞中的細胞定位情況，利用FISH技術(shù)對circ_ZCCHC24進行了顆粒細胞定位分析，結(jié)果顯示circ_ZCCHC24定位于山羊卵泡顆粒細胞的胞質(zhì)中(圖4)，表明circ_ZCCHC24可能發(fā)揮“miRNA海綿”的功能。后續(xù)將開展與circ_ZCCHC24具有結(jié)合關(guān)系的miRNA的篩選和驗證工作。

4 結(jié) 論

本研究首次對山羊卵泡差異表達的circRNA circ_ZCCHC24進行了初步研究，對其進行了成環(huán)驗證、表達分析和細胞定位。為后期進一步研究circ_ZCCHC24調(diào)控母羊卵泡發(fā)育的分子機理，挖掘出高產(chǎn)母羊的特有調(diào)控通路奠定了基礎(chǔ)，也為高繁殖力山羊品種的培育提供新靶點。