洪 海，馮 偉，李 燕，曲 欣，孫鳳軍△

(1.北京衛(wèi)戍區(qū)豐臺第十五離職干部休養(yǎng)所門診部，北京 100141； 2.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038)

大腸埃希菌是臨床最常見的致病菌之一，近年來伴隨抗菌藥物的廣泛使用，其對抗菌藥物的敏感性逐年降低，碳青霉烯耐藥菌株檢出率越來越高[1]。而目前針對碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的感染尚無有效的治療手段，主要采取多種藥物聯(lián)用的方式進行治療，但療效有限，且使治療的不良反應增加。碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的主要耐藥機制為產(chǎn)碳青霉烯酶，而對非產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的耐藥機制研究較少。因此，明確細菌的耐藥機制將為碳青霉烯耐藥大腸埃希菌感染治療中抗菌藥物的選用提供理論依據(jù)。

AcrAB是大腸埃希菌最常見的主動外排泵，AcrAB的高表達與大腸埃希菌多種耐藥相關[2-3]，AcrAB抑制劑羰基氰氯苯腙可顯著增加藥物敏感性。AcrAB在碳青霉烯耐藥菌株中的作用尚少見報道，本研究擬收集臨床分離碳青霉烯耐藥大腸埃希菌，根據(jù)是否產(chǎn)碳青霉烯酶將其分為產(chǎn)酶組和非產(chǎn)酶組，并用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測acrAB基因表達的差異，分析acrAB在大腸埃希菌耐碳青霉烯類抗菌藥物中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株 20株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌來源于陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院和重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，將其分別命名為SW1-SW10和CY1-CY10。

1.1.2主要試劑及設備 氨芐西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、亞胺培南(imipenem，IMP)、美洛培南、氨曲南、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和阿米卡星(中國食品藥品檢定研究所)，他唑巴坦(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，哥倫比亞血瓊脂平板(重慶龐通醫(yī)療器械有限公司)，MH培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)，2×Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)，細菌DNA、RNA提取純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，cDNA 合成試劑盒、2×Realtime PCR Master Mix(上海東洋紡生物科技有限公司)，Tris和瓊脂糖(上海生工生物工程股份有限公司)，多點接種儀(日本Sakuma公司)，超聲破碎儀、NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1最低抑菌濃度(MIC)測定 采用瓊脂平板倍比稀釋法檢測抗菌藥物對細菌的MIC值。細菌接種于哥倫比亞血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。用無菌生理鹽水將細菌比濁至0.5個麥氏單位?？咕幬镉蒙睇}水進行倍比稀釋，使其藥物終濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL。采用多點接種儀將稀釋菌液接種在含不同濃度抗菌藥物的MH瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～20 h進行結(jié)果判讀。

1.2.2改良Carba NP法檢測碳青霉烯酶類型 參照文獻[4]方法，將細菌接種于3 mL的MH肉湯中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12～18 h。然后100倍稀釋轉(zhuǎn)接于3 mL的MH肉湯中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至600 nm處吸光度值(A600值)為1.0～1.4。取1.5 mL菌液在4 ℃、5 000×g條件下離心5 min，棄上清液，菌體用20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)洗2次。菌體沉淀懸于500 μL的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)中，在冰浴條件下超聲裂解菌體，然后在4 ℃條件下以最大轉(zhuǎn)速離心5 min。取50 μL上清液分別與50 μL的底物Ⅰ、底物Ⅱ、底物Ⅲ、底物Ⅳ、底物Ⅴ混合，37 ℃下孵育1～2 h后根據(jù)最后顯色結(jié)果判斷菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的類型。

1.2.3碳青霉烯酶耐藥基因檢測 采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA。參照文獻[5]設計合成碳青霉烯酶耐藥基因引物序列。PCR反應體系(20 μL):2×Taq MasterMix 10 μL，正向和反向引物各0.3 μL，DNA模板0.4 μL，雙蒸水(ddH2O)9.0 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35次循環(huán)；末次循環(huán)后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，并將陽性產(chǎn)物送Invitrogen公司進行測序。測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)上進行Blast比對。

1.2.4RT-PCR檢測碳青霉烯酶陰性和陽性菌株acrAB基因表達的差異 采用細菌RNA基因組提取試劑盒分別對碳青酶烯酶陰性和陽性菌株的總RNA進行提取純化，然后用超微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳對RNA濃度和純度進行定量和定性分析。采用First Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應條件:42 ℃ 10 min，30 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。反應完畢，cDNA產(chǎn)物中加入60 μL RNase Free H2O，混勻，-20 ℃保存?zhèn)溆?。acrB引物序列:正向引物TGA TGG TTG TCG GCG TTA，反向引物AGT TCT CAC CAC CCA GCT。RT-PCR反應體系(20 μL):2×Realtime PCR Master Mix 10 μL，正向和反向引物各0.3 μL，cDNA 2 μL,ddH2O補足至20 μL。RT-PCR反應條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以16S rRNA作為內(nèi)參基因進行分析。

1.2.5亞-MIC IMP對碳青霉烯酶陰性菌株acrAB基因表達的影響 碳青霉烯酶陰性菌株接種于血瓊脂平板上進行過夜培養(yǎng)。挑取細菌單菌落接種于10 mL LB肉湯中震蕩培養(yǎng)過夜。藥物處理組:取100 μL過夜培養(yǎng)物加入9.9 mL含IMP的LB肉湯中，使其藥物終濃度為1/4 MIC?？瞻讓φ战M:100 μL過夜培養(yǎng)物加入9.9 mL的LB肉湯中。37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)過夜后進行RNA提取。然后采用RT-PCR方法檢測亞-MIC IMP對acrB基因表達的影響。

2 結(jié) 果

2.1MIC測定結(jié)果 碳青霉烯耐藥大腸埃希菌對臨床常見抗菌藥物的耐藥性見表1。細菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有較高的耐藥性，而對阿米卡星的敏感率最高。

2.2碳青霉烯酶檢測結(jié)果 采用CarbNP法檢測20株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的碳青霉烯酶類型(圖1)，結(jié)果顯示，有12株細菌的Ⅱ孔和Ⅲ孔由紅色變成黃色，提示產(chǎn)B酶；有1株細菌的Ⅱ孔和Ⅳ孔變色，提示產(chǎn)A酶；而有7株菌的Ⅰ～Ⅴ孔均沒變色，不產(chǎn)酶。

表1 碳青霉烯耐藥大腸埃希菌對臨床常見抗菌藥物的耐藥性(n=20)

圖1 CarbNP法檢測菌株產(chǎn)碳青霉烯酶類型結(jié)果

圖2 碳青霉烯耐藥大腸埃希菌acrAB基因表達結(jié)果

2.3碳青霉烯酶耐藥基因擴增結(jié)果 PCR擴增和測序結(jié)果顯示，8株菌攜帶NDM-1基因，3株菌攜帶IMP-4基因，有1株攜帶KPC-2基因，其他8株菌不攜帶碳青霉烯酶基因。其中菌株CY6產(chǎn)酶實驗篩選時為陽性，而PCR擴增結(jié)果為陰性，即CarbNP試驗結(jié)果與耐藥基因PCR檢測的相符度為95%(19/20)。

2.4acrAB基因表達差異分析 20株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌acrAB基因表達結(jié)果見圖2。其中，7株碳青霉烯酶陰性菌株具有較高的acrAB基因表達水平，而產(chǎn)碳青霉烯酶菌株acrAB基因表達水平相對較低。

2.5亞-MIC IMP對碳青霉烯酶陰性菌株acrAB基因表達的影響 亞-MIC IMP對碳青霉烯酶陰性菌株acrAB基因表達的影響結(jié)果見圖3。1/4 MIC IMP均能誘導菌株的基因表達(P<0.05)。

a:P<0.05，b:P<0.01，與對照組比較
圖3亞-MICIMP對碳青霉烯酶陰性大腸埃希菌acrAB基因表達的影響

3 討 論

碳青霉烯類抗菌藥物具有抗菌譜廣、抗菌活性能力強、不良反應少、對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶穩(wěn)定性好等特點，因此是臨床治療β-內(nèi)酰胺類耐藥細菌感染的首選藥物。隨著細菌耐藥的增高，導致碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛和不合理使用，使得碳青霉烯類耐藥菌逐年增高，給臨床治療帶來了較大困難。碳青霉烯酶主要存在于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌中，在大腸埃希菌中并不多見，但中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)數(shù)據(jù)顯示近幾年該菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性逐年增加[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌對臨床常用的抗菌藥物均表現(xiàn)出較高的耐藥性，這與文獻報道的碳青霉烯耐藥腸桿菌多為泛耐藥和多耐藥菌株結(jié)果一致[8-9]，其原因可能為在抗菌藥物壓力條件下，細菌通過移動序列和質(zhì)粒獲得更多的耐藥基因，耐藥基因的共同表達導致了多耐藥和泛耐藥菌株的出現(xiàn)。

碳青霉烯酶的產(chǎn)生是大腸埃希菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的最主要原因。目前，碳青霉烯酶根據(jù)氨基酸序列及分子結(jié)構(gòu)特點可分為A類(絲氨酸蛋白酶)、B類(金屬酶)和D類[苯唑西林酶(OXA酶)][10]。Carba NP表型確證試驗是2015年美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的用于檢測腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌和不動桿菌屬細菌產(chǎn)碳青霉烯酶類型的方法。研究表明，該方法對于檢測A類和B類碳青霉烯酶靈敏度和特異度較好(均大于90%)，而對OXA-48型碳青霉烯酶具有較低的靈敏度[11]。PCR作為耐藥基因檢測的金標準，本研究通過兩種方法檢測20株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的耐藥基因，結(jié)果顯示僅有7株不產(chǎn)酶，其中8株NDM陽性，3株IMP陽性，1株KPC陽性，而有1株產(chǎn)酶卻PCR擴增陰性，可能因存在碳青霉烯酶基因的變異而導致擴增失敗。Carba NP試驗結(jié)果與耐藥基因PCR檢測的相符度為95%，因Carba NP為表型試驗，更為準確，也有利于抗菌藥物的選擇，作為一種快速、簡單、便于大規(guī)模檢測的方法具有更廣闊的的應用前景。研究中碳青霉烯耐藥菌株其耐藥基因陽性率為60%，主要流行的碳青霉烯酶為NDM和KPC，與國內(nèi)流行的種類相似[12]，并未發(fā)現(xiàn)國外流行的VIM和OXA酶[13]，該結(jié)果說明碳青霉烯酶的分布具有較強的地域差異。NDM是大腸埃希菌最主要的碳青霉烯酶，在2009年才首次發(fā)現(xiàn)，遠遲于KPC和IMP等酶的報道[14]。在本研究中NDM是最主要的碳青霉烯酶類型，提示NDM具有快速傳播的特點，臨床應引起高度的重視。

產(chǎn)生RND家族外排泵是大腸埃希菌一個重要的耐藥機制，此家族包括AcrAB-TolC、AcrCD-TolC和AcrEF-TolC 3個外排泵，其中AcrAB-TolC因具有底物譜廣、外排能力強等特點而研究較多[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯酶陰性菌株具有較高的acrAB基因表達。有研究表明，acrAB高表達與喹諾酮類、頭孢他啶和四環(huán)素類抗菌藥物耐藥相關[16-17]。而碳青霉烯酶陽性菌株的acrAB基因表達水平較低，可能由于碳青霉烯酶水解IMP藥物，使藥物在細菌體內(nèi)蓄積的濃度較低，不足以激活acrAB的表達。此外，碳青霉烯酶主要存在于質(zhì)粒中，而質(zhì)粒在抗菌藥物壓力作用下不斷進化，可攜帶多種抗菌藥物的水解酶和鈍化酶，在短時間內(nèi)即可使抗菌藥物快速降解，acrAB的作用被弱化。1/4 MIC IMP對碳青霉烯酶陰性菌株acrAB基因均具有明顯的誘導作用，說明acrAB高表達在大腸埃希菌耐碳青霉烯類藥物中具有一定的作用。然而，acrAB并沒有特異性，其高表達對于菌株產(chǎn)生高耐藥和泛耐藥也同樣具有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯耐藥菌株對多種抗菌藥物均顯示出較高的耐藥性，提示在抗菌藥物壓力作用下，細菌耐藥性會不斷增高，因此臨床應根據(jù)其藥物敏感性選擇聯(lián)合使用抗菌藥物。此外，acrAB的高表達是大腸埃希菌耐藥的重要因素，是亞-MIC抗菌藥物誘導細菌耐藥的機制之一，因此臨床治療耐藥菌引起的感染時應加大抗菌藥物給藥劑量，提高血藥濃度，使其盡快達到或超過細菌MIC值，這對于增加治療效果及預防出現(xiàn)更高水平的耐藥具有重要意義。