夏平友, 張 全, 肖同梅, 倪賢華, 劉學(xué)風(fēng), 張新勇

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

冬瓜籽是葫蘆科植物冬瓜干燥成熟的種子[1]，其味甘，性微寒[2]。冬瓜籽營(yíng)養(yǎng)豐富且有很高的藥用價(jià)值，具有清熱化痰等效果[3-4]。冬瓜籽中含有皂苷等物質(zhì)，具有抗氧化等作用[5]，研究顯示皂苷具有抑制血小板聚集，降低血脂等作用[6]，棘孢曲霉菌株可以經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生白頭翁皂苷糖苷酶[7]。半仿生法主要通過(guò)模擬胃、小腸、大腸內(nèi)環(huán)境酸度來(lái)模仿藥物在機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)原理提取藥物中活性成分[8]。國(guó)內(nèi)關(guān)于半仿生法對(duì)冬瓜籽中主要藥效成分的提取工藝研究較少，故本文在半仿生法的基礎(chǔ)上用正交試驗(yàn)法優(yōu)化冬瓜籽中皂苷提取工藝，為冬瓜籽相關(guān)研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

儀器：HH-6恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；HDM-1000D攪拌電熱套(江蘇省榮華儀器制造有限公司)；UV-1601紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京分析瑞利儀器有限公司)；LE204E/02電子天平(上海書培實(shí)驗(yàn)有限公司)。試劑：所用試劑均為分析純(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。材料：人參皂苷Rb1(上海源葉生物有限公司，批號(hào)：B21051)；冬瓜籽(單邊，安徽亳州)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照液配制 精密稱定人參皂苷Rb1對(duì)照品15.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中。

1.2.2 對(duì)照液吸光度測(cè)定 向20 mL具塞試管中分別加入對(duì)照液0、0.15 mL，75 ℃水浴揮干溶液，分別加入3%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸0.2、0.8 mL，75 ℃水浴反應(yīng)15 min，再放入冰水充分冷卻后加入冰醋酸5.0 mL，搖勻后靜置4 min，以相同溶劑在相同操作下作為空白對(duì)照，由掃描結(jié)果可知在551 nm處較好。另取7支20 mL試管分別加入0、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75 mL對(duì)照液，在551 nm測(cè)吸光度,以橫坐標(biāo)為對(duì)照液濃度C,縱坐標(biāo)為吸光度y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算R2。

1.2.3 待測(cè)液配制 將冬瓜籽粉碎過(guò)12目篩，稱定9份冬瓜籽粉，每份精密稱定5.000 0 g。根據(jù)半仿生法模擬人體內(nèi)部消化環(huán)境，人體胃中下部pH值為1.0～2.0，大腸和小腸pH值為4.0～7.0，十二指腸pH值為7.0～8.5，以水作為提取溶劑，分別在不同溫度、時(shí)間、液料比下對(duì)同一份冬瓜籽粉加熱回流提取3次，總時(shí)間比為2∶1∶2，每次過(guò)濾后保留濾渣，并用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液依次調(diào)節(jié)pH值為2.0、6.0和7.5，合并3次提取液，濃縮定容到500 mL容量瓶并編號(hào)待測(cè)液1～9號(hào)。

1.2.4 待測(cè)液皂苷含量測(cè)定 從1～9號(hào)容量瓶各吸取待測(cè)液1.0 mL并在70 ℃水浴揮干溶劑后用甲醇溶解，經(jīng)過(guò)濾后將濾液移至2.0 mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，從中移取0.40 mL至20 mL試管中，測(cè)定吸光度y，計(jì)算求得皂苷含量(mg/g)。

1.2.5 加樣回收試驗(yàn) 從已知冬瓜籽皂苷含量1～5號(hào)待測(cè)液中每份吸取1.0 mL，分別加入對(duì)照液0.10 mL,在1.2.4節(jié)下按相同方法處理，測(cè)定吸光度y并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得皂苷含量(mg/g)，結(jié)果表明該法正確、穩(wěn)定。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 提取溫度考察 分別稱取5份5.000 0 g冬瓜籽粉于500 mL圓底燒瓶中，液料比為1∶20，提取總時(shí)間90 min，在一系列溫度(60、70、80、90、100 ℃)條件下用緩沖液調(diào)節(jié)最終pH值分別為2.0、6.0、7.5，按1.2.2節(jié)下處理，在1.2.4節(jié)下測(cè)定皂苷含量(mg/g)。

1.3.2 提取時(shí)間考察 取5個(gè)500 mL圓底燒瓶分別加入5份5.000 0 g冬瓜籽粉，在液料比、提取溫度分別為1∶20和90 ℃時(shí)，在一系列提取時(shí)間(90、120、150、180、210 min)條件下,用PBS緩沖液調(diào)節(jié)最終pH值為2.0、6.0、7.5，按1.2.2節(jié)下處理，在1.2.4節(jié)下測(cè)定皂苷含量(mg/g)。

1.3.3 液料比考察 稱取5份冬瓜籽粉，每份5.000 0 g分別置于500 mL圓底燒瓶中，設(shè)定提取溫度為90 ℃，提取總時(shí)間為180 min，在一系列液料比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)條件下用PBS緩沖液調(diào)節(jié)最終pH值為2.0、6.0、7.5，在1.2.4節(jié)下測(cè)定皂苷含量(mg/g)。

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在其他條件相同情況下，以冬瓜籽皂苷含量為指標(biāo)考察提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)對(duì)冬瓜籽皂苷提取率的影響，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

表1 冬瓜籽皂苷單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照品吸收曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

向20 mL具塞試管中分別加入對(duì)照液0、0.15 mL，75 ℃水浴揮干溶液，分別加入3%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸0.2、0.8 mL，75 ℃水浴反應(yīng)15 min，再放入冰水充分冷卻后加入冰醋酸5.0 mL，搖勻后靜置4 min，以相同溶劑在相同操作下作為空白對(duì)照，掃描間隔為1 nm，結(jié)果見(jiàn)圖1。確定最佳吸收波長(zhǎng)為551 nm。分別取對(duì)照液0、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75 mL按相同預(yù)處理在551 nm處測(cè)定吸光度。以縱坐標(biāo)為吸光度y，橫坐標(biāo)為濃度C，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=19.001C-0.075 1，R2=0.999 6(圖2)。

圖1 吸收曲線

圖2 人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同因素對(duì)皂苷提取率的影響

2.2.1 提取溫度對(duì)皂苷含量的影響 在溫度較低時(shí)皂苷溶解度不高，溶液中皂苷含量不高，當(dāng)溫度超過(guò)一定時(shí)，溶液副反應(yīng)程度增大導(dǎo)致皂苷含量偏低，故呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖3)。

圖3 提取溫度

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)皂苷含量的影響 當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，冬瓜籽中皂苷成份提取不完全，其含量隨著時(shí)間的增大而增大，但當(dāng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，皂苷會(huì)在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境下發(fā)生降解，導(dǎo)致皂苷含量降低，所以皂苷含量隨著時(shí)間的增大其含量先上升后下降(圖4)。

圖4 提取時(shí)間

2.2.3 液料比對(duì)皂苷含量的影響 當(dāng)提取溶劑較少時(shí)，皂苷提取速率會(huì)降低，導(dǎo)致皂苷含量較低，當(dāng)提取溶劑較多時(shí)皂苷提取速率也會(huì)隨之增大，所以當(dāng)液料比增大時(shí)，皂苷含量也會(huì)隨之增大最后趨于穩(wěn)定(圖5)。

圖5 液料比

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由上述試驗(yàn)結(jié)果可以得出，當(dāng)提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為180 min,液料比為1∶20時(shí)皂苷提取得率較好。為確定半仿生法優(yōu)化冬瓜籽皂苷提取最佳試驗(yàn)條件，采用L9(34)正交試驗(yàn)表，以冬瓜籽皂苷含量為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)(表2～3)。

表2 冬瓜籽皂苷正交試驗(yàn)表

表3 冬瓜子皂苷正交試驗(yàn)方差分析表

注:〔*〕表示在F[0.05]顯著；〔**〕表示在F[0.01]顯著。

由極差分析可以得出各自影響因素強(qiáng)弱為RC>RA>RB，故最優(yōu)組合為C2、A2、B3，即液料比為1∶20,時(shí)間為180 min,溫度為90 ℃。

3 結(jié)論與討論

半仿生法通過(guò)模擬機(jī)體內(nèi)部環(huán)境，模仿藥物在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[9]，并且在酸性和堿性環(huán)境下提取可以使有效成分損失較少[10]。酸或堿能破壞磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，能讓細(xì)胞壁進(jìn)一步水解，故能夠提高提取效率[11]。本文用半仿法和正交試驗(yàn)優(yōu)化冬瓜籽中皂苷提取工藝[12]。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定各因素最佳考察范圍。從溫度和時(shí)間對(duì)冬瓜籽皂苷含量影響的單因素試驗(yàn)可以看出，其濃度隨著溫度和時(shí)間的增大先上升后下降，在提取溫度較低時(shí)冬瓜籽皂苷隨著溫度的增大其溶解度增大故皂苷含量增大，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)皂苷含量降低較為明顯，這可能是冬瓜籽皂苷在高溫時(shí)發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化[13]，冬瓜籽皂苷中含有親水性基團(tuán)，從而使其在濃度隨時(shí)間的增加而增大，但在此試驗(yàn)環(huán)境下通過(guò)緩沖液調(diào)節(jié)pH值至強(qiáng)酸性或弱堿性，而強(qiáng)酸性、弱堿性環(huán)境可以使皂苷降解，隨著時(shí)間的增加其含量降低，故提取率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。隨著液料比的增加，皂苷含量先上升后保持不變，在強(qiáng)酸堿環(huán)境中可以促進(jìn)植物細(xì)胞壁水解，故當(dāng)提取時(shí)間、溫度一定時(shí)，皂苷含量隨著液料比的增加先上升后基本不變。對(duì)最佳試驗(yàn)范圍用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝，結(jié)果顯示當(dāng)液料比為1∶20、提取時(shí)間和溫度分別為180 min、90 ℃時(shí)，皂苷提取得率達(dá)0.52%。半仿生法提取優(yōu)化一種冬瓜籽皂苷最佳提取工藝操作簡(jiǎn)單結(jié)果穩(wěn)定可靠。