澳洲茶樹干旱脅迫下保護酶活性及代謝產(chǎn)物含量變化規(guī)律

劉海龍，覃子海，張 燁，肖玉菲，張曉寧，陳博雯

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院 國家林業(yè)局中南速生材繁育實驗室廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，南寧 530002）

澳洲茶樹（Melaleuca alternifolia）為桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬植物，又名互葉白千層，常綠小喬木，原產(chǎn)于澳大利亞。澳洲茶樹樹皮灰白色，厚而松軟，呈薄層狀剝落，所以又名“千層樹”。葉互生，披針形或線形，具油腺點。花白色，密集于枝頂成穗狀花序。由于從該植物中提取的茶樹精油有重要的商業(yè)價值，20世紀90年代初我國開始引進澳洲茶樹，在南方多省區(qū)種植[1-2]。項東云等[3]通過948引進項目系統(tǒng)地開展澳洲茶樹引種、良種選育、繁育、種植和加工利用技術研究。吳麗君等[4]、劉海龍[5-7]等較系統(tǒng)地開展了澳洲茶樹組培技術研究，形成了澳洲茶樹組培工廠化育苗系列技術。此外，廣西林科院、福建林科院等單位分別篩選出4-松油醇型和1，8-桉葉素型澳洲茶樹的優(yōu)株[2,8-9]，并通過無性繁殖，實現(xiàn)了優(yōu)良無性系的大規(guī)模推廣種植。

組培技術的突破以及良種的保障，確保了澳洲茶樹種植加工項目的高收益。據(jù)估算，在廣西等地種植澳洲茶樹，第1年枝葉產(chǎn)量可達3 t，可提取澳洲茶樹精油36 kg（按1.2%的得油率），產(chǎn)值可達7 200元（按20萬/t的精油價格），提取精油后的枝葉還可用于熬制多糖多酚45 kg（按1.5%的得率），產(chǎn)值可達9 000元（按20萬/t的價格），兩項相加產(chǎn)值可達24.3萬元/（hm2·a）。第2年起，枝葉產(chǎn)量超過4 t，產(chǎn)值相應提高。此外，澳洲茶樹枝葉還可生產(chǎn)其它系列產(chǎn)品，如黃酮浸膏、茶樹純露、生物質(zhì)燃料等。

澳洲茶樹在我國種植已近20年，在平地、丘陵、山地均有種植，種植地氣候類型也各有不同，但對澳洲茶樹抗旱性的研究尚未見開展。本研究擬對澳洲茶樹干旱脅迫下的保護酶活性及代謝產(chǎn)物含量進行測定，以初步了解澳洲茶樹在干旱脅迫下的反應機制，為深入了解澳洲茶樹的抗旱性能，有效推廣澳洲茶樹種植，保證產(chǎn)量，提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采用盆栽試驗,盆口直徑40 cm,高30 cm,每盆裝土20.0 kg。使用廣西林科院所培育的4-松油醇型澳洲茶樹良種組培苗種植半年后的植株作為供試材料，土壤為第四紀紅壤，質(zhì)地為輕黏土，土壤中有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀平均含量分別為11.3、0.14、0.16、6.43 g/kg。盆栽最大土壤持水量為43.4%。

1.2 干旱脅迫

試驗在廣西林科院生物所（108.35°E，22.92°N）進行，白天氣溫27.0～37.5℃,夜間氣溫22.5～26.0℃,相對濕度55%。本研究共種植15盆澳洲茶樹，試驗苗木在處理前連續(xù)澆水3 d，然后讓其自然干旱。從2018年8月17—31日，連續(xù)脅迫處理15 d。土壤中相對含水量采用電子秤（精度0.001 kg）稱質(zhì)量法測定,每隔1天稱質(zhì)量1次。土壤相對含水量=（土壤質(zhì)量－土壤干質(zhì)量）/（土壤飽和質(zhì)量-土壤干質(zhì)量）×100%。

1.3 生理指標測定

1.3.1 酶活性的測定

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）以及過氧化物酶（POD）活性的測定采用李合生[10]的方法；硝酸還原酶（NR）活性測定采用徐龍光[11]的方法；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性的測定采用鄧修惠等[12]的方法。以上生理指標每間隔1天測定1次。

1.3.2 代謝產(chǎn)物的測定

脯氨酸（Pro）的測定采用茚三酮顯色法[13]，可溶性糖含量的測定采用蒽酮法[14]，每間隔1天測定1次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0和Excel 2016對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，全部數(shù)據(jù)是3次重復實驗的平均值±標準誤差。

2 結(jié)果

2.1 不同時間的土壤相對含水量

橫坐標表示月份-日期，縱坐標表示相對含水量（圖1）。相對含水量隨著脅迫時間延長而逐漸降低，8月23日后趨穩(wěn)。

圖1 不同時間的土壤相對含水量Fig.1 Relative water content of soil at different times

2.2 干旱脅迫對澳洲茶樹保護酶活性的影響

過氧化物酶（POD）活性及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性的變化趨勢基本相同，都表現(xiàn)出隨著時間推移逐步下降的趨勢（圖2、6）。POD活性在前3天（17—19日）下降幅度較大，后期趨緩，25日后接近為0。GSH-PX活性在19—23日下降幅度較大，后期趨緩，27日后接近為0。

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）以及硝酸還原酶（NR）活性的變化趨勢基本相同，其活性均為前期升高，后期降低的趨勢（圖3、4、5）。SOD活性上升及降低趨勢均較緩，后期仍然能檢測出超過1 500的相對活性。CAT活性在前期快速升高（17—21日），后期逐步降低，29日后接近為0。NR活性在前3天快速升高（17—19日），后期逐步降低，25日后趨近0。

圖2 不同時間的葉片POD活性Fig.2 POD activity of leaves at different times

圖3 不同時間的葉片SOD活性Fig.3 SOD activity of leaves at different times

圖4 不同時間的葉片CAT活性Fig.4 CAT activity of leaves at different times

圖5 不同時間的葉片NR活性Fig.5 NR activity of leaves at different times

2.3 干旱脅迫對澳洲茶樹代謝產(chǎn)物的影響

圖6 不同時間的葉片GSH-PX活性Fig.6 GSH-PX activity of leaves at different times

可溶性糖含量前期呈上升趨勢（17—21日），中期趨于穩(wěn)定（80 mg/g左右），后期呈下降趨勢（27—31日）（圖7）。

脯氨酸（Pro）的含量變化為前期含量有小幅波動（17—23日），中期含量快速升高（23—25日），后期呈下降趨勢（25—31日），直至接近于0（圖8）。

圖7 不同時間的葉片可溶性糖含量Fig.7 Soluble sugar content of leaves at different times

圖8 不同時間的葉片脯氨酸含量Fig.8 Proline content of leaves at different times

3 討論

3.1 澳洲茶樹抗旱性相關保護酶指標的變化

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD） 和過氧化氫酶（CAT）3種酶組成了生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)，它們在清除超氧自由基、H2O2和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮重要作用，在逆境脅迫時發(fā)揮著重要的自身保護功能[15]?？购的芰姷闹仓晖芫S持較高水平的抗氧化酶活性[16]。植物細胞對活性氧的忍受水平存在一個閾值。在閾值范圍內(nèi)，植株可以通過提高保護酶活性來消除自由基帶來的傷害；超過這個閾值，保護酶活性會下降，活性氧的積累超過其清除能力，植株便受到損害[17]。本研究中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，表明這2種保護酶前期在閾值范圍內(nèi)能發(fā)揮出了保護酶的功效，后期超過閾值范圍，則出現(xiàn)活性下降，失去了對植株的保護功能。本研究中過氧化物酶（POD）活性則僅僅檢測出下降的趨勢，可能的原因有：一可能土壤含水量下降過快，或檢測時間間隔過長，導致未檢測到前期上升的趨勢；二可能澳洲茶樹葉片中的過氧化物酶（POD）與超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）對干旱脅迫的反應機制有所不同。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）是酶促清除機制中的關鍵酶，其作用是催化還原型谷胱甘肽（GSH）與過氧化氫反應，阻止OH-自由基的產(chǎn)生，避免質(zhì)膜過氧化，從而實現(xiàn)保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的目的[18]。本研究中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性同過氧化物酶（POD）活性變化規(guī)律類似，僅檢測到下降的變化趨勢，究其原因可能也與POD類似。

硝酸還原酶（NR）是氮代謝關鍵酶之一，其活性直接影響植株的氮代謝，植物中氮代謝生理與抗旱性存一定的相關性，高水平的氮代謝能有效增強植物的抗旱性[19]。本研究中硝酸還原酶（NR）的活性同超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性變化規(guī)律類似，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，表明在閾值范圍內(nèi)NR酶能將NO3-還原成NH4+，再通過清除NH4+的累積，解除其毒害，使氮素的同化加速，從而提高氮代謝水平。超過閾值范圍，NR酶活性降低，NH4+出現(xiàn)累積，植株受損，氮代謝水平隨之降低。

3.2 澳洲茶樹抗旱性相關代謝產(chǎn)物的變化

干旱脅迫條件下，植株可通過增加游離氨基酸含量來有效提高植株的滲透調(diào)節(jié)能力及保水性能，因此游離氨基酸含量是植株適應干旱脅迫的一個重要指標[17]，但較長時間的干旱脅迫可能會使生成的游離氨基酸進一步分解。本研究中，干旱脅迫使澳洲茶樹植株游離脯氨酸含量顯著增加，與郝敬虹等[20]的研究結(jié)果基本一致，后期脯氨酸分解，檢測到的含量逐步降為0。

干旱脅迫下，可溶性糖能有效降低葉片滲透勢、維持細胞膨壓，阻止水分喪失，達到保水目的，從而進行自身調(diào)節(jié)，適應干旱環(huán)境條件[21]。細胞質(zhì)中可溶性糖含量的大量增加，有效提高了植物細胞滲透調(diào)節(jié)能力，減低了對質(zhì)膜的傷害，對植物抵抗逆境十分重要[22]。本研究中可溶性糖前期升高，中期趨于穩(wěn)定，與常麗等[21]的研究結(jié)果一致，即可溶性糖含量表現(xiàn)為重度脅迫條件下最大，干旱處理有利于可溶性糖含量的積累。后期可溶性糖含量降低，推測為細胞受損，導致可溶性糖流失所至。

綜上所述，干旱處理條件下澳洲茶樹葉片中有3種保護酶活性上升（SOD、CAT、NR），表明這3種酶啟動了保護機制，以應對逆境。另外2種保護酶（POD、GSH-PX）則未檢測到活性上升和啟動保護的情況，說明不同物種對干旱脅迫的應對機制及參與反應的酶種類有所不同。干旱脅迫情況下代謝產(chǎn)物脯氨酸和可溶性糖的含量均顯著增加，出現(xiàn)累積，這個結(jié)果與多數(shù)研究的結(jié)果一致，表明這2種物質(zhì)是提高植株滲透調(diào)節(jié)能力和保水性能的重要物質(zhì)。

大多數(shù)的研究表明輕度或中度干旱脅迫條件下，保護酶活性上升，重度干旱脅迫條件下，保護酶活性下降。由此可推測8月19日土壤相對含水量為34.1%時為輕度脅迫，此時NR活性顯著升高，啟動保護，SOD活性也有小幅升高；8月21日土壤相對含水量為29.8%時為中度脅迫，此時CAT活性升高到最大值；而8月23日土壤相對含水量為23.5%時為重度脅迫，所有保護酶活性都表現(xiàn)為大幅下降。而根據(jù)可溶性糖含量的變化則可推測，8月21日土壤相對含水量為29.8%時已接近重度脅迫，因為此時可溶性糖含量接近最大值。

由此，我們認為最適宜澳洲茶樹生長的土壤相對含水量的值應該在34.1%以上，低于這個值則進入干旱脅迫的狀態(tài)。而土壤相對含水量低于23.5%，甚至29.8%時則進入重度干旱脅迫的狀態(tài)，會對澳洲茶樹葉片造成不可逆的傷害，甚至危及植株的存亡。

目前，澳洲茶樹已在我國南方的大部分省區(qū)推廣，如廣西、廣東、海南、福建、云南、江西、湖南等省區(qū)，以及西部的四川、重慶等地。澳洲茶樹不僅可在平地種植，更常見的是在這些地區(qū)的山地種植，表現(xiàn)出一定的抗旱性。因此，評價澳洲茶樹的抗旱性還要綜合考慮各方面的研究結(jié)果，如對其根系的吸水、儲水能力的研究等。而開展本研究也有其理論及現(xiàn)實意義，其結(jié)果可為確定最適宜澳洲茶樹生長的土壤相對含水量提供依據(jù)，在人工灌溉條件下可以通過調(diào)節(jié)土壤相對含水量來促進澳洲茶樹增產(chǎn)豐產(chǎn)。