4-松油醇型白千層枝葉連續(xù)提取茶樹油及黃酮的技術(shù)

陳海燕，李桂珍，梁校彰，梁忠云，楊 漓

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，南寧 530002；2.廣西澳樹寶生物科技有限公司，南寧 530002）

白千層芳香油樹是桃金娘科（Myrlaceaca）白千層屬常綠灌木至小喬木樹種，原產(chǎn)于澳大利亞東部的昆士蘭州和新南威爾士的北部，因其枝葉中含有α-松油烯，桉葉素，γ-松油烯，4-松油醇等揮發(fā)性成分，長(zhǎng)期以來作為香料植物在澳洲廣為種植[1]。20世紀(jì)90年代初，我國(guó)開始引進(jìn)澳洲白千層，在廣東、廣西、福建等地逐漸進(jìn)行大面積的種植。茶樹油是利用互葉白千層（Melaleuca altennifolia）或輪葉白千層（M.linariifolia）細(xì)枝和葉進(jìn)行水蒸汽蒸餾得到的符合ISO 4730:2017標(biāo)準(zhǔn)的4-松油醇型白千層油。其品種單一，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力不強(qiáng)，銷售價(jià)格逐年下滑，資源優(yōu)勢(shì)未能轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。蒸餾提取精油后的殘留枝葉少部分用于種植平菇[2]，大多用作燃料燃燒或者直接作為廢物遺棄，未被充分利用，造成資源浪費(fèi)。

近年來學(xué)者開始對(duì)枝葉的組分進(jìn)行研究利用。Vieira等[3]對(duì)白千層中黃酮、甾醇和三萜皂甙等化合物進(jìn)行研究；劉布鳴等[4]和林霄等[5]對(duì)互葉白千層成分進(jìn)行分析研究，同時(shí)測(cè)定互葉白千層中槲皮素、山萘酚、沒食子酸的含量；李燕婧等[6-7]對(duì)互葉白千層枝葉醇提物、水提物的藥理作用進(jìn)行研究，證明其有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗過敏、止癢的作用而且毒性??；劉祥義等[8]利用乙醇提取澳洲茶樹黃酮和β-谷甾醇。此外，劉祥義等[8]通過添加夾帶劑，利用超臨界二氧化碳流體萃取干燥的原料，通過3級(jí)分離，提取澳洲茶樹精油及黃酮甙。白千層枝葉中含有大量的有效成分，其中以黃酮類化合物為主[10]。本實(shí)驗(yàn)利用水做浸提劑，從提取茶樹油后的廢渣廢液中提取黃酮，旨在充分利用資源，實(shí)現(xiàn)精油和白千層有效成分連續(xù)制備，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，同時(shí)也為其它香料植物在提取精油后的利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

白千層枝葉：2017年6月采集于廣西澳樹寶生物科技有限公司田東基地。

1.2 儀器

Agilent 7890A氣相色譜儀；紫外分光光度計(jì)，UV-2501PC SHIMADZU公司；WAY-2S數(shù)字阿貝折射儀INESA儀電物光；SGW-2自動(dòng)旋光儀，上海晶科；實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥機(jī)SP-1500上海順儀科技；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 茶樹油及黃酮提取

將白千層新鮮枝葉切成小于3 cm的小段，裝入圓底燒瓶中，在瓶中加入1.5～2倍枝葉重量的水，裝上油水分離器和冷凝管，蒸餾2 h。蒸餾結(jié)束后，用少量的水沖洗冷凝管，冷卻，分出上層清液茶樹油。拆下油水分離器，將圓底燒瓶中的水提液倒出趁熱過濾，取濾液，并將濾渣放回圓底燒瓶中，加入1.5～2倍枝葉重量的水，裝上冷凝管加熱回流1.5 h，倒出趁熱過濾，取濾液，重復(fù)1次。合并濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定濃度的濃縮液，上噴霧干燥塔進(jìn)行干燥，得到白千層黃酮粗產(chǎn)品。

1.4 產(chǎn)品測(cè)定

茶樹油按ISO 4730:2017標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，黃酮測(cè)定方法和步驟參考文獻(xiàn)[10]。

1.5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取烘干至恒重的蘆丁標(biāo)樣0.185 5 g使用70%乙醇水溶液進(jìn)行定容至1 000 mL，配制得到0.185 5 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精確量取2.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液至25 mL容量瓶中，加入50%乙醇水溶液3 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻靜置6 min，然后加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，混勻后靜置6 min，再加入10%氫氧化鈉溶液10 mL，最后加入50%乙醇水溶液定容至25 mL，搖勻之后靜置15 min。另一組試劑作為空白參比，在波長(zhǎng)250～600 nm內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。在510 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，確定為掃描波（圖1）。

圖1 蘆丁的紫外掃描Fig.1 UV scanning of rutin

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

依次精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL至25 mL容量瓶，后處理過程同1.5.1，測(cè)定其吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（圖2），得到線性回歸方程式1。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.2 Rutin standard curve

1.6 樣品測(cè)定

稱取樣品0.2 g（準(zhǔn)確至0.000 2 g），用50%乙醇水溶液溶解，定容至100 mL，吸取2 mL，后處理過程同1.5.1，測(cè)定其吸光值。通過回歸方程計(jì)算白千層粗黃酮產(chǎn)品黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油提取及質(zhì)量

水蒸氣蒸餾生產(chǎn)茶樹油有多種工藝，以復(fù)蒸工藝所得產(chǎn)品質(zhì)量最佳[11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)蒸工藝提取茶樹油，產(chǎn)品理化指標(biāo)和成分指標(biāo)符合ISO 4730:2017標(biāo)準(zhǔn)（表1），這說明復(fù)蒸工藝適合生產(chǎn)茶樹油。

表1 茶樹油產(chǎn)品質(zhì)量Tab.1 Product quality of tea tree oil

2.2 黃酮的制備

本實(shí)驗(yàn)主要利用提取精油后的水液和廢渣提取水溶性黃酮。提取的水液經(jīng)真空濃縮至一定濃度，上噴霧干燥塔進(jìn)行干燥。

2.2.1 不同進(jìn)口溫度對(duì)固物回收率的影響

取濃度為40%的濃縮液，進(jìn)料流量400 mL/h，考察不同進(jìn)口溫度對(duì)固物回收率的影響。結(jié)果表明，溫度低于160℃，干燥不完全，溫度達(dá)到180℃以上，產(chǎn)品色澤變深，收率下降，進(jìn)口溫度160～170℃為宜（表2）。

表2 不同溫度對(duì)物料收率的影響Tab.2 Effect of different temperatures on material yield

2.2.2 不同進(jìn)料流量對(duì)固物回收率的影響

取濃度為40%的濃縮液，進(jìn)口溫度160～170℃，考察不同進(jìn)料流量對(duì)固物回收率的影響。結(jié)果表明，流量低，物料干燥時(shí)間長(zhǎng)，流量過高，干燥不完全，收率降低，流量控制在350～400 mL/h為宜（表3）。

表3 不同進(jìn)料流量對(duì)物料收率的影響Tab.3 Effect of different feed flow rates on material yield

2.2.3 不同濃度濃縮液對(duì)固物回收率的影響

將濃縮液配制成濃度為20%，30%，40%，50%，60%，上干燥塔干燥（表2）。濃度低于30%的物料噴霧干燥時(shí)，水分多、易掛壁、損失大、濃度高于50%難于進(jìn)料，無法回收產(chǎn)品；濃度在30%～50%可回收產(chǎn)品，其中濃度為40%的濃縮液，上塔干燥后固物收率為74.6%，效果較佳（表4）。

2.2.4 穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)

取濃度為40%的濃縮液，進(jìn)料流量400 mL/h，進(jìn)口溫度170℃，進(jìn)行干燥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，固物平均收率75.1%（表5）。

表4 不同進(jìn)料濃度對(duì)物料收率的影響Tab.4 Effect of different feed concentration on material yield

表5 穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)的收率Tab.5 Material yield of stability experiment

2.3 黃酮含量測(cè)定

取濃度為40%的濃縮液上塔干燥，進(jìn)口溫度160～170℃，進(jìn)料流量400 mL/h，制備的產(chǎn)品按1.5.2方法測(cè)定黃酮含量為18.1%，這說明產(chǎn)品中含有其他活性物質(zhì)，產(chǎn)品易受潮，可能含有多糖等成分。劉布鳴等[13]報(bào)導(dǎo)，醇提黃酮濃縮液過柱純化，可得到高達(dá)50%的黃酮，因此水溶性黃酮產(chǎn)品中其他有效成分及其黃酮純化有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

采用復(fù)蒸工藝提取茶樹油，產(chǎn)品質(zhì)量符合ISO 4730:2017標(biāo)準(zhǔn)。

采用水從生產(chǎn)茶樹油的廢渣和廢液中連續(xù)提取白千層黃酮，固含量在40%濃縮液上噴霧塔干燥，進(jìn)料流量為400 mL/h，進(jìn)口溫度為160～170℃，得到的產(chǎn)品黃酮含量為18.1%。黃酮純化有待進(jìn)一步研究。

對(duì)于白千層枝葉利用的研究主要有兩個(gè)方向：一是用水蒸氣從互葉或輪葉白千層細(xì)枝和葉中提取4-松油醇型白千層精油（茶樹油）；二是用水或溶劑直接從白千層枝葉提取水溶物或醇提物等活性物質(zhì)，并未從中分離出精油。要制備符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4730:2017的茶樹油，原料品種極為重要。引進(jìn)白千層主要是提取精油，隨著茶樹油應(yīng)用推廣，生產(chǎn)精油后互葉或輪葉白千層枝葉中的活性成分利用受到關(guān)注。劉祥義等[8]通過添加夾帶劑，利用超臨界二氧化碳流體萃取，分離提取澳洲茶樹精油及黃酮甙，但用超臨界對(duì)高壓設(shè)備要求高；劉布鳴等[13]利用生產(chǎn)精油廢渣用乙醇提取黃酮，并過柱純化分離出高純度黃酮。本實(shí)驗(yàn)利用提取精油后的廢渣直接用水提取黃酮，相對(duì)用乙醇提取更有優(yōu)越性。連續(xù)制備茶樹油和黃酮等活性成分，可充分利用資源，緩解單一精油受到價(jià)格波動(dòng)引起原料種植的困境，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展。