賀便 成超超 王攀

摘 要：以松針為原料，采用雙酶法-超聲輔助提取法研究優(yōu)化松針多糖的提取工藝。以料液比、超聲溫度、超聲時間、復(fù)合酶添加量及酶解時間為因素，研究其對松針多糖提取率的影響，并通過正交試驗優(yōu)化工藝參數(shù)。結(jié)果表明，料液比、超聲溫度、超聲時間、復(fù)合酶的添加量和酶解時間等因素對松針多糖的提取率有明顯的影響作用；當(dāng)料液比為1∶25，超聲溫度60℃，超聲時間25min，復(fù)合酶（纖維素∶果膠酶=1∶1）添加量5%，酶解時間2h時，松針多糖的提取率最高，為3.97%。

關(guān)鍵詞：松針；多糖；工藝優(yōu)化

中圖分類號 TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）07-0019-04

松針為松科植物松屬植物的葉，別名豬鬃松葉、松毛、山松須[1]，是松屬類植物的主要副產(chǎn)物之一[2]，是一種分布廣泛、生長速度快的天然可再生資源[3]，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值[2，4]，食用歷史悠久[5-7]。雪松是可供藥用的13種松樹之一[8]，針葉藥用歷史悠久。松針主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、黃酮類、苯丙素類、有機(jī)酸類、三萜類、甾體類、多糖及針葉膠類等[9，10]，其活性成分的多樣性使其具有抗氧化、抑菌防腐、降糖降血脂、抗癌和護(hù)肝的功效[11]。隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，松針的藥用價值和營養(yǎng)價值日益受到關(guān)注[12]，當(dāng)前松針提取物在醫(yī)藥和食品方面的開發(fā)利用價值逐漸受到重視，工業(yè)開發(fā)潛力巨大[13]。為此，筆者開展了優(yōu)化雙酶法-超聲輔助提取松針多糖工藝的研究，以期為松針的綜合深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 材料：松針，2018年4月份于采自商洛，纖維素酶（400U/mg）、果膠酶（500U/mg），其余試劑均為分析純。儀器：UV-1100型紫外分光光度儀（上海美析儀器有限公司）；R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KH5200E型超聲波清洗器（昆山樂創(chuàng)超聲儀器有限公司）；SI-234型電子天平（丹佛儀器有限公司）；SHZ-D型抽濾機(jī)（鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司）；LJYE-100型恒溫水浴鍋（北京科偉儀器有限公司）；TDL-40B型大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 松針多糖的提取方法 采集新鮮雪松松針，經(jīng)干燥粉碎后，過篩，分別用石油醚、95%乙醇處理，減壓抽濾后烘干，取過40目篩預(yù)處理松針粉末1g，按1∶25的料液比加入蒸餾水，充分混合，進(jìn)行超聲處理（50℃，20min），然后在纖維素酶：果膠酶=1∶1條件下添加量為4%，酶解2h，酶解結(jié)束后抽濾，向濾液中加入5倍體積95%乙醇，并在4℃條件下靜置5h，隨后取出離心（4000r/min，15min），將沉淀物依次經(jīng)無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，干燥后得松針多糖粗品[14]。

1.2.2 單因素實驗 按照1.2.1的方法，分別在料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，超聲溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，超聲時間為10min、15min、20min、25min、30min，復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1）的添加量為2%、3%、4%、5%、6%，酶解時間為1h、1.5h、2h、2.5h、3h的條件下提取松針多糖，考察其對松針多糖提取率的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取合適的因素水平進(jìn)行正交實驗，以松針多糖提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝。

1.3 松針多糖的含量測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱取20mg在105℃干燥至恒重的葡萄糖于500mL容量瓶中，加蒸餾水搖勻定容，分別取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6mL于試管中，加蒸餾水補(bǔ)至2mL，再各加入6%苯酚1mL及濃硫酸5.0mL，充分混合冷卻，室溫靜置20min，于490nm處測定其吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.3.2 松針多糖提取率的測定 按照1.2.1的方法提取的松針粗多糖復(fù)溶，并定容于50mL容量瓶中，吸取0.1mL按1.3.1的方法采用苯酚-硫酸法測吸光度，通過線性方程計算松針多糖濃質(zhì)量。多糖的提取率計算公式為：

松針多糖提取率（%）=松針多糖質(zhì)量/松針質(zhì)量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 按1.2.3的方法進(jìn)行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，結(jié)果見圖1。

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對松針多糖提取率的影響 由圖2可知，料液比對松針多糖的提取影響顯著。當(dāng)料液比在1∶10～

1∶30時，隨料液比的增大整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且當(dāng)料液比為1∶25時達(dá)到最高，為1.97%。這可能是當(dāng)料液比較低時，多糖隨溶劑量的增大，溶出量增大，多糖提取率升高，當(dāng)溶劑量增大到一定程度時，導(dǎo)致底物濃度過低，多糖溶出減慢，同時其他雜質(zhì)溶出增加，導(dǎo)致多糖提取率降低。

2.2.2 超聲溫度對松針多糖提取率的影響 由圖3可知，超聲溫度對松針多糖的提取影響顯著。當(dāng)超聲溫度為30～60℃時，松針多糖的提取率隨超聲溫度的升高呈上升趨勢，并于60℃達(dá)到最大，松針多糖提取率為2.41%；當(dāng)超聲溫度高于60℃后，隨溫度繼續(xù)上升，多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于在一定的溫度方位內(nèi)，隨溫度的升高，加快了松針多糖溶出，使得多糖提取率明顯升高，但當(dāng)溫度過高時，多糖糖苷鍵也可能斷裂、失活，導(dǎo)致多糖提取率降低[16]。

2.2.3 超聲時間對松針多糖提取率的影響 由圖4可知，超聲時間對松針多糖的提取影響顯著，隨超聲時間的延長，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)超聲時間為10～25min時，隨超聲時間的延長，松針多糖的提取率呈上升趨勢，且當(dāng)超聲時間為25min時，提取率達(dá)到最大值，為1.15%；當(dāng)超聲時間大于25min后，松針多糖的提取率呈下降趨勢。這可能是隨超聲時間的延長，超聲的空穴效應(yīng)使細(xì)胞壁進(jìn)一步破碎，導(dǎo)致多糖溶出物不斷增加，多糖提取率逐漸上升，但當(dāng)提取時間過長，超聲空穴作用會造成提取液中多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致多糖提取率下降。

2.2.4 復(fù)合酶添加量對松針多糖提取率的影響 由圖5可知，復(fù)合酶濃度對松針多糖提取率有顯著影響，隨復(fù)合酶濃度的增大松針多糖的提取率呈上升趨勢。當(dāng)復(fù)合酶濃度為2%～5%時，隨復(fù)合酶濃度的增大松針多糖的提取率顯著上升；當(dāng)復(fù)合酶濃度大于5%后，松針多糖的提取率變化相對較小，上升趨勢減弱。這可能是當(dāng)酶的添加量達(dá)到一定程度后，已接近飽和，繼續(xù)增大酶使用量并不能進(jìn)一步提升反應(yīng)的速率。

2.2.5 酶解時間對松針多糖提取率的影響 由圖6可知，酶解時間對松針多糖的提取影響顯著。當(dāng)酶解時間為1～2h時，隨著酶解時間的延長松針多糖的提取率呈上升趨勢，當(dāng)酶解時間為2h時，提取率達(dá)到最高，為2.24%；當(dāng)酶解時間大于2h后，松針多糖的提取率呈微弱下降的趨勢。這可能由于隨酶解處理時間的延長，有助于酶與底物接觸，有效促使多糖的溶出；但隨時間的繼續(xù)延長，因底物的消耗，導(dǎo)致松針多糖的提取率變化不大甚至略有下降。

2.3 正交實驗結(jié)果 在單因素實驗基礎(chǔ)上，以松針多糖提取率為考察指標(biāo)，選取對松針多糖提取率影響較大的因素：料液比、超聲溫度、超聲時間、復(fù)合酶濃度、酶解時間為考察因素進(jìn)行正交實驗，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，各因素影響松針多糖提取率的主次順序為C>A>B>E>D，即復(fù)合酶濃度>超聲溫度>超生時間>料液比>酶解時間，最優(yōu)水平組合A3B3C3D2E3，即料液比1∶25、超聲溫度60℃、超聲時間25min、復(fù)合酶（纖維素∶果膠酶=1∶1）添加量為5%、酶解時間2h。利用最佳工藝參數(shù)，進(jìn)行驗證實驗，平行實驗3次，測得松針多糖的提取率為3.97%。

3 結(jié)論

采用雙酶法-超聲輔助提取松針多糖，結(jié)果表明，料液比、超聲溫度、超聲時間、復(fù)合酶添加量及酶解時間對松針多糖的提取有一定的影響。利用雙酶法-超聲輔助提取松針多糖時，當(dāng)料液比為1∶25，超聲溫度60℃，超聲時間25min，復(fù)合酶（纖維素∶果膠酶=1∶1）添加量5%，酶解時間2h時，松針多糖的提取率最高，為3.97%。

參考文獻(xiàn)

[1]董朱，范輝，王良萍.松針抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥科技，2018，25（02）：307-309.

[2]邱冰，胡惠靜.松針在醫(yī)藥中的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2017，34（06）：130-133.

[3]郝金偉，張國鋒，容井容，等.松針精油的提取及開發(fā)利用的研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（23）：6118-6123.

[4]王群.幾種松科植物活性成分及多酚抗氧化性能力的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2016.

[5]張晉蔚，錢江，何玉巧，等.松針提取液對慢性便秘小鼠腸道抗氧化能力及通便作用的影響[J].食品工業(yè)科技，2014，35（21）：351-353，357.

[6]胡鈞，呂圭源，李萬里，等.馬尾松松針提取物保健及藥用價值研究[J].林產(chǎn)化工通訊，1992（06）：10-11.

[7]黃順東.松針臨床應(yīng)用及藥理研究概況[J].實用中醫(yī)藥雜志，2005（08）：514-515.

[8]劉東彥，張莉霞，石曉峰，等.雪松松針中莽草酸和多糖的提取工藝研究[J].中藥材，2017，40（08）：1914-1916.

[9]馬趣環(huán)，石曉峰，沈薇，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化雪松松針多糖提取工藝研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（03）：1106-1110.

[10]白朝輝，石曉峰，劉東彥，等.雪松松針的化學(xué)成分及藥理作用研究概述.中國藥師，2012，15（12）：1791-1793

[11]劉康柯，曹小燕.松針有效成分提取及藥理活性研究進(jìn)展[J].廣州化工，2018，46（13）：6-8.

[12]龔恒佩，劉祖望，陳妍月，等.松針的顯微及分子鑒別研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2018，47（03）：300-306.

[13]李丹蘇. 松針抗菌物的分離提取及其活性研究[D].吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[14]許小向，尹小莉，洪艷平，等.火炬松松針多糖提取工藝及其抗氧化性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2016，36（03）：114-120.

[15]許小向，洪艷平，胡捷敏，等.松針多糖提取工藝及穩(wěn)定性研究[J].食品科技，2015（06）：218-223.

[16]李恒，李莉梅，何春梅，等. 野生仙人掌多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36（4）：210-214.

（責(zé)編：張宏民）