浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

菊科植物天名精（Carpesium abrotanoides Linn.），在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，其性味甘、寒，主瘀血、血瘕欲死[1]，臨床上廣泛用于帶狀皰疹、流行性腮腺炎、口腔糜爛、毒蛇咬傷等癥的治療[2]。研究發(fā)現(xiàn)，其全草的乙醇提取物對LPS誘導(dǎo)的體外炎癥反應(yīng)有一定緩解作用，但具體機(jī)制尚不清楚[3]。

炎癥是許多疾病的主要危險(xiǎn)因素，而巨噬細(xì)胞是組成機(jī)體抵御外來病原微生物（如細(xì)菌、病毒和真菌等）入侵的第一道防線的重要免疫細(xì)胞[4-5]。巨噬細(xì)胞通常通過識(shí)別、吞噬和殺死微生物，在宿主免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。炎癥期間，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）以及白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎細(xì)胞因子[6]，這些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生可能會(huì)對機(jī)體器官產(chǎn)生不利影響。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌外膜中最常見的致病性內(nèi)毒素成分，在LPS刺激下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7會(huì)發(fā)生快速炎癥反應(yīng)，釋放大量促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6，以及炎癥介質(zhì)前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）、COX-2和iNOS[6]；而金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的革蘭陽性病原菌，可引起嚴(yán)重感染，是多種感染性疾病發(fā)病和致死的主要原因[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過提取天名精根的有效成分，以RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對象，采用LPS和滅活的金黃色葡萄球菌刺激RAW264.7細(xì)胞，構(gòu)建體外巨噬細(xì)胞炎癥模型，研究天名精根提取物對巨噬細(xì)胞體外炎癥的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和菌種 RAW264.7細(xì)胞株、金黃色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 43300均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液購于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號：2017022705）；胎牛血清購于杭州四季青生物制品公司（批號：150208）；LPS（011：B4）購自 Sigma公司（批號：L2630）；核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）p65鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司（批號：B0612）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、羊抗鼠IgG購自北京康為世紀(jì)生物有限公司（批號：30147、10146）。

1.3 主要儀器 SpectraMax190酶標(biāo)儀購于美國Molecular Devices公司；3111 CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo Fisher Scientific 公 司 ；PowerPacTMHCBIORAD電泳儀購于美國Bio-Rad公司；5427R低溫高速離心機(jī)購于德國 Eppendorf公司；Stepone plus熒光定量PCR儀購于美國ABI公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購于寧波新芝科器研究所；DMI8熒光顯微鏡購于德國Leica公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 天名精根提取物制備 天名精采集于杭州市富陽區(qū)場口鎮(zhèn)上村附近山域，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)教研室鑒定為菊科天名精屬天名精的全草。人工采摘地上部分高50cm及以上的植株，將完整植株置于陽光下直曬，1～2d后裝入筐中，放通風(fēng)處1～2d，待水分向表層滲出后，復(fù)曬l～2d直至全干。曬干后，待全草自然降溫至常溫，剪取根部，放入粉碎機(jī)中粉碎，過60目篩。收集粉末，置于滅菌烘干的500mL玻璃瓶中密封，4℃保存?zhèn)溆?。精密稱取5.0g天名精根粉末，加80%乙醇超聲提取60min，重復(fù)3次，合并濾液，旋蒸揮干后冷凍干燥得0.553g天名精根乙醇提取物（ethanol extract of Carpesium abrotanoides Linn.’s root，ECA），得率為 10.67%；1.5g ECA 加入石油醚超聲提取40min，重復(fù)3次，合并濾液，旋蒸揮干，冷凍干燥后得到0.16g天名精根石油醚提取物（petroleum ether extract of Carpesium abrotanoides Linn.’s root，PCA），得率10.6%。每100.00μg ECA相當(dāng)于937.21μg天名精根粉末；每100.00μg PCA相當(dāng)于8.84mg天名精根粉末。

1.4.2 熱滅活的金黃色葡萄球菌（heat-inactivated preparations of Staphylococcus aureus pathogens，SAC）制備 金黃色葡萄球菌菌株在LB培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)。待達(dá)到對數(shù)生長期（600nm處的OD值為0.5，即為 5×107個(gè)/mL），調(diào)整數(shù)量后 80℃熱滅活 1h，以培養(yǎng)基洗滌2次，最終將數(shù)量調(diào)整為1×108個(gè)/mL，-20℃保存。

1.4.3 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 檢測 色譜條件：C18柱(Φ4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈由 5%梯度洗脫至100%；測定時(shí)間30min；檢測波長210nm，流速1mL·min-1，柱溫 30℃，進(jìn)樣體積 10μL。

1.4.4 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞采用含有10%胎牛血清、青霉素100U·mL-1及鏈霉素100U·mL-1的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每3d傳代1次。

1.4.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔200μL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng) 24h，分別用 0、10、25、50、100、200μg·mL-1ECA或PCA處理細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為 200μL。作用 6h 后每孔加入 5g·L-1MTT 20μL，暗室孵育4h，棄去培養(yǎng)液，然后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μL，以空白孔調(diào)零，震蕩混勻后，酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上490nm波長測定各孔吸光度值。

1.4.6 qPCR檢測Toll樣受體-2（Toll-like receptor-2,TLR-2）、TLR-4、髓樣分化因子 88（myeloid differentiation primary response 88,MyD88）、IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于12孔板，每孔1mL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)24h，分為正常對照組（不加干預(yù)的RAW264.7細(xì)胞），炎癥模型組（2μg·mL-1LPS孵育RAW264.7細(xì)胞6h或MOI=5的SAC孵育RAW264.7 細(xì)胞 3h），ECA 組 （100μg·mL-1ECA 與LPS共同孵育6h或與SAC共同孵育3h），PCA組（100μg·mL-1PCA與LPS共同孵育6h或與SAC共同孵育3h）。細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，以Trizol法提取各組細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定總RNA的純度及濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。所有引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列如表1所示。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5min，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 5s，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)。mRNA相對表達(dá)量計(jì)算采用Ratio=2-ΔΔCT方法，ΔCT1=對照組目的基因CT值-對照組內(nèi)參基因CT值，ΔCT2=實(shí)驗(yàn)組目的基因CT值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因CT 值，ΔΔCT=ΔCT2－ΔCT1，代入公式 2-ΔΔCT計(jì)算，即得到mRNA相對表達(dá)量。

1.4.7 Western blot檢測NF-κB p65蛋白的表達(dá)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，接種于6孔板，每孔2mL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)24h，細(xì)胞分組同1.4.6中。處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌5次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，混勻后超聲破碎細(xì)胞；4℃、12 000r/min離心30min，轉(zhuǎn)移上清液于新的EP管中，以BCA法測定蛋白濃度。一定量的蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸5min，SDS-PAGE電泳3h，200mA恒流轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST漂洗3次后分別加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜。次日TBST漂洗3次，加入二抗37℃孵育2h，TBST漂洗3次后進(jìn)行ECL顯色。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶，以內(nèi)參為對照，計(jì)算各處理組目的蛋白的表達(dá)情況。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，大于兩組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPLC分析 ECA的HPLC檢測結(jié)果見圖1。PCA的HPLC檢測結(jié)果見圖2，其中以峰A的物質(zhì)為主，于28.78min出峰，峰高1 928mAU。

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較 MTT結(jié)果顯示，與正常對照組比較，當(dāng)ECA或PCA濃度≥200μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率降低（P＜0.01），提示高濃度的ECA或PCA對細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。見圖3。故采用100μg·mL-1ECA和100μg·mL-1PCA進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 天名精根提取物對細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響 與正常對照組比較，2μg·mL-1的LPS刺激6h后，RAW264.7 細(xì)胞中的炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)增加（P＜0.01），而 100μg·mL-1的 ECA或PCA干預(yù)后，這些炎癥因子mRNA的表達(dá)均顯著下降（P＜0.01）。與正常對照組比較，以MOI=5的SAC刺激細(xì)胞 3h 后，RAW264.7 細(xì)胞中 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)增加（P＜0.01），而 100μg·mL-1的ECA或PCA干預(yù)后，相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。見圖 4。

2.4 天名精根提取物對NF-κB表達(dá)的影響 與正常對照組比較，無論是LPS刺激6h還是以MOI=5的SAC刺激RAW264.7細(xì)胞3h后，細(xì)胞中的NF-κB mRNA和NF-κB p65蛋白表達(dá)量均明顯增加（P＜0.01），在 100μg·mL-1ECA 或 PCA 干預(yù)后，NF-κB mRNA和NF-κB p65蛋白表達(dá)量低于LPS組和SAC組（P＜0.01）。見圖 5。

圖1 ECA的HPLC檢測結(jié)果Fig.1 ECA HPLC test results of ECA

圖2 PCA的HPLC檢測結(jié)果Fig.2 HPLC test results of PCA

圖3 不同濃度天名精根提取物對細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of different concentration extracts of Carpesium abrotanoides Linn.’s root on cell proliferation

2.5 天名精根提取物對TLRs/MyD88 mRNA表達(dá)的影響 LPS刺激6h后，與正常對照組比較，RAW264.7細(xì)胞TLR-2的mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），TLR-4及 MyD88 mRNA 表達(dá)均增加（P＜0.01，P＜0.05）。ECA或 PCA 干預(yù)后 TLR-2的 mRNA表達(dá)與LPS組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；TLR-4 mRNA表達(dá)量明顯低于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；PCA干預(yù)后MyD88 mRNA表達(dá)量明顯低于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而ECA干預(yù)后MyD88 mRNA表達(dá)與LPS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 不同天名精根提取物對炎癥因子mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of ECA or PCA on mRNA expression of inflammatory factors

SAC刺激3h后，與正常對照組比較，TLR-2及MyD88 mRNA表達(dá)增加（P＜0.01），TLR-4 mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。ECA或PCA干預(yù)后，TLR-2 mRNA的含量明顯低于SAC組（P＜0.01），MyD88 mRNA 表達(dá)低于 SAC 組（P＜0.05，P＜0.01），而TLR-4 mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖6。

3 討論

天名精又名鹿活草，是一種兩年生草本植物，常應(yīng)用于傳統(tǒng)中醫(yī)治療中，其主要藥效成分為倍半萜內(nèi)酯[8]?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)表明，天名精提取物具有抗菌、抗炎等功效[9-11]。既往實(shí)驗(yàn)通常分離其地上部分、花或果實(shí)，提取活性成分進(jìn)行研究[9-11]，在本研究中筆者根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)方提示，以天名精根作為研究對象，從天名精根中分離有效成份，希望發(fā)現(xiàn)并確定其功能化合物。經(jīng)過HPLC檢測，與汪蕾等[12]、沈冰冰等[13]以及楊勇勛等[14]的研究進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，ECA和PCA的檢測圖譜與目前已知的天名精化合物群無法重合。對PCA中主要的A峰物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)其分子量為360.2，與已知的天名精所提取物無一相同，故筆者推測ECA和PCA所含主要成分可能是一類新的萜類物質(zhì)。

圖5 不同天名精根提取物對NF-κB表達(dá)的影響Fig.5 Effects of ECA or PCA on the expression of NF-κB

TLR是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面受體家族，是連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。TLR-2作為革蘭陽性菌的主要識(shí)別受體，在抗菌免疫中發(fā)揮顯著作用。TLR-2在人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面都呈較高水平的表達(dá)[15]，一般和TLR-1或TLR-6形成二聚體，能夠識(shí)別革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的脂蛋白、革蘭陽性菌的脂磷壁酸、分支桿菌的阿拉伯糖甘露糖脂，TLR-2和TLR-1二聚體還可以識(shí)別革蘭陰性菌的三酰基脂蛋白，TLR-2和TLR-6二聚體可以識(shí)別革蘭陽性菌的二?；鞍?，具有較廣泛的識(shí)別普遍性[15]。而TLR-4是一種革蘭陰性菌的主要識(shí)別受體，其可以激活下游蛋白質(zhì)復(fù)合體相互作用，釋放促炎細(xì)胞因子或Ⅰ型干擾素（interferon type Ⅰ，IFN-Ⅰ）[16]。

本研究在體外模擬了急性炎癥常見的革蘭陰性和革蘭陽性病原菌刺激巨噬細(xì)胞的炎癥模型，研究結(jié)果表明，天名精根提取物降低LPS誘發(fā)的巨噬細(xì)胞中 TLR-4介導(dǎo)的 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達(dá)。同時(shí)還可以緩解由SAC引起的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。在研究中發(fā)現(xiàn)ECA和PCA可以抑制由SAC刺激TLR-2介導(dǎo)的 IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA 表達(dá)。目前研究表明無論TLR-2還是TLR-4主要通過MyD88依賴和β-干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR-domaincontaining adaptor inducing interferon-β，TRIF）依賴的兩個(gè)下游分支途徑調(diào)節(jié)炎癥基因的表達(dá)，而MyD88是參與TLRs介導(dǎo)的炎癥表達(dá)的關(guān)鍵信號適配基因，其可以募集IL-1受體相關(guān)激酶1（IL-1 receptor associated kinase1，IRAK1）和 IRAK4 至 TLRs[17]，這個(gè)信號復(fù)合體也可以促進(jìn)這些激酶的磷酸化，磷酸化的IRAK1可以激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumour necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6），此外可以激活I(lǐng)-κB激酶（I-kappaB kinase，IKK）復(fù)合體，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 的活化[18]。NF-κB是在TLRs介導(dǎo)的炎癥中起核心作用的基因，已有研究在IFN-γ、IL-10、TNF-α 和 IL-6等大多數(shù)細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了NF-κB編碼結(jié)合位點(diǎn)[19-21]。在無刺激的條件下，NF-κB通常與I-κB固定于細(xì)胞質(zhì)中，而當(dāng)外源病原菌刺激時(shí)，I-κB磷酸化導(dǎo)致NF-κB p65和p50亞基釋放，易位于核并與相關(guān)的DNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)[22]。本研究結(jié)論也支持了這一觀點(diǎn)，無論是LPS激活TLR-4還是SAC激活TLR-2都會(huì)使MyD88的表達(dá)增加，促進(jìn)NF-κB活化，ECA和PCA均可以抑制這一通路的激活，從而緩解炎癥癥狀。本研究也證實(shí)了，天名精根提取物對革蘭陰性和陽性菌引起的巨噬細(xì)胞體外炎癥均有良好的緩解作用。

圖6 不同天名精根提取物對TLRs/MyD88 mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of ECA or PCA on mRNA expression of TLRs/MyD88

綜上所述，天名精根提取物可以抑制由LPS和SAC刺激RAW264.7細(xì)胞引起的體外炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制TLRs信號通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)方首次對天名精根進(jìn)行了活性成分提取，得到一類新型的萜類物質(zhì)，并進(jìn)行藥理活性研究，為天名精的開發(fā)提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但所得提取物的結(jié)構(gòu)式尚待進(jìn)一步分析與實(shí)驗(yàn)。