應(yīng)帥兵張伊娜邱華鋒黃平

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）又稱糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病的慢性微血管病變的主要并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）、腎功能衰竭[1-2]，是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。腎小球臟層上皮細(xì)胞又稱足細(xì)胞,是一種終末分化的多突狀細(xì)胞，參與了腎小球毛細(xì)血管袢的穩(wěn)定，在維持腎小球濾過屏障，調(diào)節(jié)超濾系數(shù)以及保持腎小球基底膜的正常形態(tài)中起重要作用。DN病理改變表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚、足細(xì)胞足突廣泛融合甚至消失、足突裂孔數(shù)量減少、系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)行性積聚，這主要與腎小球內(nèi)灌注壓的增加、各種血管活性激素途徑和氧化應(yīng)激的激活、糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）誘導(dǎo)的病理改變、多元醇通路活化及細(xì)胞因子損傷等機(jī)制有關(guān)[3]。研究表明，足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化涉及到蛋白尿的發(fā)生以及腎臟疾病的發(fā)展[4]，因此保護(hù)足細(xì)胞對于控制DN病情以及防止疾病發(fā)展意義重大。

厄貝沙坦片為血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）受體拮抗劑，臨床上廣泛用于合并高血壓的2型糖尿病患者的治療。研究證明，厄貝沙坦能顯著抑制腎小球系膜基質(zhì)的沉積，抑制足細(xì)胞數(shù)量減少，減輕腎小球足細(xì)胞和基底膜的病理變化，從而保護(hù)足細(xì)胞，減輕DN的腎功能損傷[5]。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬消渴病，主要病機(jī)是脾腎氣陰兩虛、瘀血阻滯，以本虛標(biāo)實為主要特點，益氣養(yǎng)陰、活血化瘀是DN最重要的治則之一，因此化瘀通絡(luò)中藥是DN的基礎(chǔ)用藥。益氣養(yǎng)陰活血方是以益氣養(yǎng)陰活血為治則制成的經(jīng)驗方[6]，既往臨床研究表明，益氣養(yǎng)陰活血方可以改善DN患者腎功能，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，緩解腎損傷[7]，其作用機(jī)制與控制糖脂代謝、抑制腎臟纖維化、抗氧化有關(guān)[8]。尹娟娟等[9]研究提示，益氣養(yǎng)陰活血方能夠增加巨蛋白表達(dá)，但該方是否對腎組織足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化存在影響，尚未見文獻(xiàn)報道。本研究以腹腔注射鏈脲佐菌素（strepotozotocin，STZ）溶液的方法制備DN大鼠模型，以益氣養(yǎng)陰活血方進(jìn)行干預(yù)，同時以厄貝沙坦為陽性對照，觀察大鼠腎功能指標(biāo)及足細(xì)胞的形態(tài)變化，進(jìn)一步探究益氣養(yǎng)陰活血方對DN大鼠腎臟的保護(hù)作用靶點和機(jī)制，為益氣養(yǎng)陰活血方的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 5周齡清潔級健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量（body weight,BW）為（200±20）g，購自上海斯萊克有限公司 [實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[實驗動物使用許可證：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠全封閉隔離飼養(yǎng)，室溫20℃，相對濕度40%～60%，每日光照12h。

1.2 主要試劑與儀器 益氣養(yǎng)陰活血方由黃芪20g、麥冬 15g、白術(shù) 12g、五味子 15g、知母 12g、山萸肉12g、桃仁 12g、紅花 10g、茯苓 15g、玄參 15g、旱蓮草15g、川芎12g、女貞子15g、葛根15g組成，以上藥物均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供，水煎濃縮至5g·mL-1；厄貝沙坦片購于賽諾菲(杭州)制藥有限公司（規(guī)格：150mg/片，國藥準(zhǔn)字：J20130049)，以無菌蒸餾水配置成2.5mg·mL-1的混懸液；STZ購于美國Sigma公司（批號：SLBB8126V），以0.1mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，調(diào)節(jié)pH至4.2～4.5，配成1%STZ溶液，使用時應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，避免冰浴中操作；血清肌酐（serum creatinine,SCr）檢測試劑盒、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所（批號：20180314、20180321）。羅氏血糖儀為德國羅氏公司產(chǎn)品；7020全自動生化分析儀及H-7650日立透射電子顯微鏡均為日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 造模和分組 以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，檢測血糖陰性，按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為正常組8只和DN造模組24只。所有大鼠禁食12h后稱重，DN造模組按60mg/kg劑量在大鼠腹腔左側(cè)注射現(xiàn)配的1%STZ溶液。72h后經(jīng)尾靜脈采血檢測各組大鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）。DN大鼠造模依據(jù)文獻(xiàn)[10]，以FBG≥16.7mmol·L-1為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。對于未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，1周后按50mg/kg劑量再次行STZ腹腔注射，經(jīng)尾靜脈采血復(fù)查血糖。本次DN造模組24只大鼠均一次造模成功。造模成功后將24只大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組和厄貝沙坦組，每組8只。

1.3.2 給藥方法 造模成功后，各組大鼠均繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，其中中藥組和厄貝沙坦組以60kg體重成人用量的10倍換算大鼠給藥劑量[11]。換算結(jié)果如下：中藥組大鼠以益氣養(yǎng)陰活血方水煎液10mL/（kg·d）灌胃，相當(dāng)于生藥劑量 50g/kg·d；厄貝沙坦組以厄貝沙坦混懸液10mL/（kg·d）灌胃，相當(dāng)于25mg/（kg·d）劑量；正常組和模型組予等體積的蒸餾水灌胃。實驗期間各組大鼠按組分籠飼養(yǎng)，每天固定時間段進(jìn)行灌胃操作，1次/d，共8周。期間所有大鼠均予普通飲食，自由飲水，未使用胰島素及其他降血糖藥物。實驗中每隔1周稱量大鼠BW并調(diào)整灌胃量。

1.3.3 標(biāo)本采集 各組大鼠均于第8周末給藥后禁食，自由飲水，12h后稱量BW，以10%水合氯醛按0.3mL/100g劑量腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動脈收集血液標(biāo)本，3 500r/min離心10min，分離血清用于檢測SCr和BUN水平。分離大鼠左側(cè)腎臟，于腎門處剪斷腎蒂，快速剝離腎臟包膜后以濾紙吸干并稱量腎臟質(zhì)量（kidney weight，KW），計算腎臟指數(shù)（kidney index，KI）。稱重后將腎臟對切成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，加入戊二醇4℃固定4h以上，待行電鏡檢查。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 一般情況觀察和KI計算 觀察各組大鼠毛色、體重、飲食、體態(tài)、靈敏度和精神狀況；第8周末稱量BW和左側(cè)腎臟KW，根據(jù)公式KI=KW（g）/BW（g）計算腎臟指數(shù)。

1.4.2 生化指標(biāo)FBG、SCr、BUN檢測 實驗期間每2周末行尾靜脈采血，用羅氏血糖儀測FBG，血糖＜16.7mmol·L-1者及時剔除。此次實驗過程中所有DN造模組大鼠FBG檢測均＞16.7mmol·L-1，按照試劑盒說明書操作，在全自動生化分析儀上測定SCr和BUN水平。

1.4.3 腎臟足細(xì)胞形態(tài)和基底膜厚度電鏡觀察 收集以3.75%戊二醇固定4h以上的大鼠腎臟標(biāo)本，以0.1mol·L-1的 PBS 漂洗 5～6 次，丙酮脫水、浸透，然后石蠟包埋、切片。將厚80～90nm的切片置于銅網(wǎng)上，醋酸鈾染液室溫染15～30min，雙蒸水洗凈后，再置于檸檬酸鋁染液中，室溫染10～20min，雙蒸水洗凈，濾紙吸干，透射電鏡下觀察[12]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，正態(tài)分布及滿足方差齊性的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；不符合條件數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況、BW和KI比較 正常組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色光澤，進(jìn)食正常，尿量正常，大便成麥粒狀，BW增加較快。模型組大鼠均精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，蜷臥拱背，毛發(fā)豎立無光澤、易脫落，伴有多飲、多食、多尿等癥狀，BW增長緩慢，大便較稀，次數(shù)多。中藥組和厄貝沙坦組有類似表現(xiàn)，但程度有所減輕。

造模前各組大鼠BW無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。給藥8周后，與正常組比較，模型組BW增長緩慢，KI明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組與厄貝沙坦組BW增長較快，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；KW 則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），KI低于模型組（P＜0.01），中藥組與厄貝沙坦組之間比較，KW、BW及KI均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BW及KI比較（±s）Tab.1 Comparison of BW and KI in each group(±s)

表1 各組大鼠BW及KI比較（±s）Tab.1 Comparison of BW and KI in each group(±s)

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01Note:Compared with normal group,△△P＜0.01;compared with model group,**P＜0.01

組別 n K W（g） B W（g） K I正常組模型組中藥組厄貝沙坦組8 8 8 8 1.8 8±0.1 5 2.0 7±0.2 6 1.9 8±0.2 7 2.0 4±0.0 4 4 1 8.3 3±1 8.7 6 3 2 2.5 0±1 2.6 6△△3 4 2.3 9±1 4.2 6△△**3 6 7.5 5±1 4.5 1△△**0.0 0 4 5±0.0 0 0 1 0.0 0 6 4±0.0 0 0 8△△0.0 0 5 8±0.0 0 0 2△△**0.0 0 5 2±0.0 0 0 2△△**

2.2 各組大鼠FBG、SCr、BUN比較 給藥前及給藥8周后，與正常組比較，模型組、中藥組和厄貝沙坦組的FBG水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而厄貝沙坦組和中藥組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組、中藥組和厄貝沙坦組大鼠 SCr、BUN 水平增高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和厄貝沙坦組上述指標(biāo)均明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；中藥組和厄貝沙坦組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腎臟組織超微結(jié)構(gòu)比較 正常組大鼠毛細(xì)血管基底膜厚度均勻一致，均在正常范圍內(nèi)，無電子致密物沉積，足細(xì)胞排列整齊，足突規(guī)則清楚，無廣泛融合。模型組基底膜明顯增厚，基底膜內(nèi)可見電子致密物沉積，足細(xì)胞排列紊亂且足突融合，裂孔數(shù)目明顯減少，足細(xì)胞胞質(zhì)線粒體明顯減少，線粒體嵴出現(xiàn)斷裂、脂滴沉積和空泡變性。與模型組比較，中藥組毛細(xì)血管基底膜增厚減輕，足細(xì)胞排列相對整齊，足突部分融合，足細(xì)胞損傷較?。欢蜇惿程菇M足突增寬，排列整齊，少數(shù)有融合，足細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷較模型組減輕。見圖1。

電鏡下測量各組基底膜厚度發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組和厄貝沙坦組基底膜增厚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），而中藥組基底膜厚度則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與模型組比較，厄貝沙坦組與中藥組基底膜較?。≒＜0.01），中藥組基底膜薄于厄貝沙坦組（P＜0.05）。見圖 2。

表2 各組大鼠FBG、SCr及BUN比較（±s）Tab.2 Comparison of FBG,SCr and BUN in each group(±s)

表2 各組大鼠FBG、SCr及BUN比較（±s）Tab.2 Comparison of FBG,SCr and BUN in each group(±s)

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note:Compared with normal group,△△P＜0.01;compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01

組別n給藥前F B G（m m o l·L-1）給藥第8周F B G（m m o l·L-1）S C r（μ m o l·L-1）B U N（m m o l·L-1）正常組模型組中藥組厄貝沙坦組8 8 8 8 5.1 8±0.7 7 1 7.5 5±1.1 3△△1 7.7 9±1.1 3△△1 7.9 5±1.1 4△△5.0 3±1.0 8 2 7.5 8±1.8 6△△1 8.4 0±1.7 2△△**1 9.2 8±1.8 6△△**3 5.4 0±3.2 6 7 1.2 5±7.4 4△△4 8.1 6±6.3 1△△**5 2.7 8±6.2 4△△**3.6 5±0.5 6 1 3.0 6±2.7 9△△1 0.5 5±1.3 2△△**1 1.1 3±1.5 2△△*

3 討論

足細(xì)胞是腎小球濾過屏障的主要組成部分，完整的結(jié)構(gòu)和足夠的數(shù)量是保證腎小球濾過膜正常運行的基礎(chǔ)。研究證明，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常、數(shù)量減少及相關(guān)分子表達(dá)變化致使腎小球濾過屏障通透性增加，從而導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生，進(jìn)一步引起腎小球硬化、腎功能進(jìn)行性喪失等病變，與DN的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[13]。張秀麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞病變與糖尿病大鼠血流動力學(xué)的改變有關(guān)。細(xì)胞因子損傷、氧化應(yīng)激、代謝紊亂等是足細(xì)胞病變的影響因素。熊何健等[15]研究顯示，高糖可通過活性氧自由基啟動足細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)其從基底膜上脫落，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)漏出，導(dǎo)致蛋白尿。

圖1 各組大鼠腎臟足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較（20 000×）Fig.1 Comparison of podocyte ultrastructure in each group(20 000×)

圖2 各組大鼠腎小球基底膜厚度比較Fig.2 Comparison of basement membrane thickness in each group

目前DN尚缺乏特效的治療方法，中醫(yī)認(rèn)為DN是在消渴的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，屬于本虛標(biāo)實之證，以脾腎氣陰兩虛為本，以血瘀阻滯為標(biāo)，病變部位在絡(luò)脈，以補(bǔ)氣益腎、化瘀通絡(luò)為治則。研究證實，益氣養(yǎng)陰活血方對DN大鼠24h尿蛋白定量、血脂、SCr、尿β2微球蛋白水平等均有改善作用[6]。李中南等[16]研究發(fā)現(xiàn)，具有益氣養(yǎng)陰活血作用的丹蛭降糖膠囊能夠明顯減輕DN大鼠的足細(xì)胞損傷。本研究通過觀察益氣養(yǎng)陰活血方對DN大鼠血糖、腎功能以及腎臟足細(xì)胞的影響，研究中藥治療DN的方法。結(jié)果顯示，益氣養(yǎng)陰活血方能夠有效降低DN大鼠FBG，改善腎功能。筆者推斷益氣養(yǎng)陰活血方可能通過減輕足細(xì)胞損傷，從而延緩腎臟病變過程，提示本方對DN早期腎臟病變有改善作用。本研究中模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜明顯增厚，伴有電子致密物沉積，足細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為數(shù)量減少、形態(tài)異常、足突紊亂融合，導(dǎo)致濾過膜完整性受損；而足細(xì)胞內(nèi)線粒體減少，可見脂質(zhì)沉積，提示DN狀態(tài)下足細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，與文獻(xiàn)報道一致。中藥組足細(xì)胞損傷減輕，提示益氣養(yǎng)陰活血方能夠保護(hù)足細(xì)胞，且改善程度優(yōu)于厄貝沙坦組。

進(jìn)一步分析益氣養(yǎng)陰活血方作用機(jī)制，方中黃芪、山萸肉為君藥，益氣固本、滋補(bǔ)肝腎；臣藥茯苓、白術(shù)益氣健脾，協(xié)助黃芪益氣；葛根、麥冬生津養(yǎng)陰；五味子、女貞子、旱蓮草協(xié)助山萸肉滋補(bǔ)肝腎、固腎澀精；佐使藥紅花、桃仁、川芎活血化瘀，補(bǔ)而不留邪，祛邪而不傷正；知母、玄參寓泄于補(bǔ)，以泄助補(bǔ)，使藥性平和。全方標(biāo)本兼治，共奏益氣養(yǎng)陰之效。李志杰等[17]研究表明，黃芪單體可提高早期DN大鼠足細(xì)胞的nephrin和podocin蛋白表達(dá)水平，從而延緩DN的病理進(jìn)展。紅花黃色素具有減低早期DN患者血清炎癥因子表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，減少腎臟氧化應(yīng)激等作用[18-19]。山萸肉預(yù)防腎臟病變的機(jī)制主要是改善氧化應(yīng)激，抑制AGEs形成[20]。還有研究證實，血管內(nèi)皮生長因子可損傷腎小管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜區(qū)[21]，張伊娜等[22]研究發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰活血方可抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，故降低血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，可能也是該方保護(hù)足細(xì)胞的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證明益氣養(yǎng)陰活血方可以通過減輕足細(xì)胞損傷起到保護(hù)腎臟功能的作用，從而治療DN，且作用與厄貝沙坦無顯著差異，為該方進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。筆者推斷益氣養(yǎng)陰活血方可能通過降低炎癥因子水平、抗氧化、影響足細(xì)胞蛋白表達(dá)、降低血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)等多途徑保護(hù)腎小球足細(xì)胞，其是否影響足細(xì)胞相關(guān)的其他蛋白表達(dá)尚有待進(jìn)一步研究。