浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

肝纖維化以肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化、增殖為主要特征，是慢性肝炎向肝硬化發(fā)展的重要病理過(guò)程。HSC的活化受氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）等諸多因素的影響，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[1]。研究表明，生物體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）引起的OS在肝纖維化形成中扮演了重要角色[2]，而蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）在細(xì)胞的 OS反應(yīng)過(guò)程中起重要作用[3-5]，富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，Pyk2）則參與了 AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞蛋白合成，與心臟間質(zhì)纖維化密切相關(guān)[6-7]，SRC也被認(rèn)為是AngⅡ調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的關(guān)鍵成員。在血管平滑肌細(xì)胞中SRC以ROS依賴的方式被G蛋白激活，并調(diào)節(jié)諸如Pyk2、兩面神激酶（Janus kinases，JAK）/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（signal transduction and activator of transcription，STAT）等下游信號(hào)。這些跡象提示，PKC、Pyk2、SRC很可能也參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，《金匱要略》所載鱉甲煎丸及其改良劑型鱉甲煎口服液能夠通過(guò)防止肝細(xì)胞變性、壞死；清除肝纖維化誘因；抑制HSC增殖；降低纖維化大鼠血漿中的腎素、AngⅡ、醛固酮活性；減少AngⅡ誘導(dǎo)HSC氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的羥自由基及單線態(tài)氧自由基等機(jī)制，從而抑制肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[8-11]。

據(jù)此，筆者進(jìn)一步提出假設(shè)，在肝纖維化形成早期階段，AngⅡ誘導(dǎo)ROS作為初始的刺激因素，通過(guò)激活有PKC、Pyk2、SRC等諸多因子參與的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致HSC增殖，以致形成肝纖維化。鱉甲煎丸能有效抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，可能與其對(duì)該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的干預(yù)有關(guān)。本研究采用MTT、熒光探針DCFH-DA、Western blot及血清藥理學(xué)等研究方法，觀察鱉甲煎丸含藥血清對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的ROS作用下HSC-LX2細(xì)胞的增殖情況以及對(duì)PKC、Pyk2、SRC蛋白表達(dá)情況的影響，以初步探討其干預(yù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200g，購(gòu)買于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-2016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184]。5只/籠，25℃恒溫，光照12h/d，普通飼料喂養(yǎng)。人源肝星狀細(xì)胞HSC-LX2購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和藥品 活性氧檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自Solarbio公司（批號(hào)：CA1410、PC0020）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自 Vetec 公司（批號(hào)：V900090）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒、二抗羊抗兔、內(nèi)參β-actin均購(gòu)自華安生物公司（批號(hào)：WK001、HA1001、CT36001）；Anti-Pyk2抗體、Anti-SRC 抗體、Anti-PKC alpha+beta 2+gamma抗體均購(gòu)自Abcam公司（批號(hào)：[E354]ab32448、[EPR5496]ab109381、[EPR18104]ab184746）；二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）購(gòu)自弗德生物公司（批號(hào)：FD0011）；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自 HyClone公司（批號(hào)：SH30809.01）；Beyo ECL plus購(gòu)自碧云天公司（批號(hào)：P0018）；胎牛血清購(gòu)自Diagnovum公司（批號(hào)：D154-500mL）。

鱉甲煎丸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)中聯(lián)藥業(yè)有限公司（批號(hào)：Z42020772）；依那普利購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司（批號(hào)：H32026567）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 MK-10干式恒溫器購(gòu)于杭州奧盛儀器有限公司；L500臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)購(gòu)于長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO公司產(chǎn)品；AE200倒置生物顯微鏡購(gòu)于Motic公司；imark全自動(dòng)酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；CLiNX掃膜儀購(gòu)于Science Instruments公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清的制備 大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分成5組：鱉甲煎丸高、中、低劑量組，依那普利組及空白組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鱉甲煎丸高、中、低劑量組分別選用60kg成人每日總服用量的20、10、5倍。鱉甲煎丸以0.9%氯化鈉溶液溶解，高、中、低劑量組分別予12g/kg·d、6g/kg·d、3g/kg·d 灌胃給藥，灌胃體積 10mL/kg；依那普利組以10mg/kg·d劑量的依那普利溶液灌胃[11]，空白組以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組均灌胃2次/d，連續(xù)給藥7d。末次給藥1h后，各組大鼠均在無(wú)菌條件下經(jīng)腹腔靜脈取血，4℃、3 000r/min離心20min分離血清，56℃滅活 30min，0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MTT法測(cè)定鱉甲煎丸含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響 按前期研究方法[9]培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-LX2 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以 1×103～1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔終體積為100μL。將細(xì)胞分為AngⅡ組、依那普利組、鱉甲煎丸高、中、低劑量組、空白血清組。各組以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁，向每孔加入新鮮制備的、經(jīng)濾膜濾過(guò)除菌的10-5mol·L-1AngⅡ處理1h，鱉甲煎丸高、中、低劑量組、依那普利組均分別設(shè)有4個(gè)濃度梯度，分別按5%、10%、15%、20%的終濃度加入相應(yīng)的含藥血清，空白血清組加入空白組大鼠血清，AngⅡ組加入胎牛血清。各組細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 24、48、72h 后，每孔加入5mg·mL-1MTT 20μL，37℃培養(yǎng) 4h后，徹底吸棄上清液，向每孔中加入150μL DMSO，置于搖床上振蕩10min，充分溶解藍(lán)紫色的甲臜沉淀，570nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值OD，代表細(xì)胞的增殖情況。

1.2.3 熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量變化 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-LX2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以5×105個(gè)/mL的密度接種于24孔板，每孔500μL。培養(yǎng)24h后，將其分為空白對(duì)照組（培養(yǎng)液）、AngⅡ組、依那普利組、鱉甲煎丸高、中、低劑量組和空白血清組。除空白對(duì)照組外，其余各組均以10-5mol/L AngⅡ處理1h，分別給予胎牛血清、依那普利含藥血清、10%鱉甲煎丸高、中、低劑量含藥血清及空白組大鼠血清。作用24h后，以PBS沖洗3次，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，加入適當(dāng)體積的DCFH-DA，DCFH-DA按照1:1000比例以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，終濃度為10μmol·L-1，37℃孵育20min。再以無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。熒光共聚焦顯微鏡觀察HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)的ROS，顏色越深，表明ROS生成量越多。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)PKC-Pyk2/SRC通路中相關(guān)蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞分為AngⅡ組、依那普利組、鱉甲煎丸高、中、低劑量組和空白血清組。先用10-5mol·L-1AngⅡ處理24h，然后分別予以各血清作用24h。參照前期研究[9]方法提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量，制膠。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。稀釋一抗（PKC 1:1 000、Pyk2 1:500、SRC 1:10 000、β-actin 1:5 000），二抗（羊抗兔 lgG，稀釋比例1:2 000），室溫下?lián)u床孵育2h。脫色、覆膜后利用凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HSC-LX2細(xì)胞增殖活性比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組中AngⅡ組與空白血清組細(xì)胞增殖活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與AngⅡ組比較，處理24h后，5%鱉甲煎丸高、中劑量組顯著抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖（P＜0.05，P＜0.01），10%、15%、20%鱉甲煎丸各劑量組細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。處理48h后，與AngⅡ組比較，5%鱉甲煎丸高、中、低劑量組均顯著抑制細(xì)胞增殖活性（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）；15%鱉甲煎丸高劑量組可顯著抑制HSCLX2細(xì)胞增殖活性（P＜0.05）；10%、20%鱉甲煎丸各劑量組細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。培養(yǎng)72h后，與AngⅡ組比較，5%鱉甲煎丸中劑量組顯著抑制細(xì)胞增殖活性（P＜0.01），10%、15%、20%鱉甲煎丸各劑量組細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖 3。

2.2 各組HSC-LX2細(xì)胞ROS含量比較 采用熒光共聚焦顯微鏡直接觀察HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化，ROS的表達(dá)在HSC-LX2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)為綠色的熒光顆粒，綠色越深，分布越密集，表明ROS含量越高。空白對(duì)照組綠色熒光顆粒顏色較淺，分布散在、稀疏；與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組綠色熒光顆粒顏色加深，分布較密集；依那普利組綠色熒光顆粒明顯少于AngⅡ組，且分布稀疏；鱉甲煎丸高劑量組綠色熒光顆粒密集程度與空白對(duì)照組和依那普利組相似，但顏色略淡；鱉甲煎丸中劑量組綠色熒光顆粒略多，且顏色加深；低劑量組，綠色熒光顆粒較明顯，密集程度與AngⅡ組相似；空白血清組綠色熒光顆粒顏色不深，分布較為稀疏。見(jiàn)圖4。說(shuō)明與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組ROS含量明顯提高；與AngⅡ組比較，依那普利組、鱉甲煎丸高、中劑量組ROS含量降低，低劑量組的變化不大。

圖1 作用24h后各組HSC-LX2細(xì)胞增殖活性比較Fig.1 Comparison of proliferation activity of HSC-LX2 cell in each group after treatment of 24h

圖2 作用48h各組HSC-LX2細(xì)胞增殖活性比較Fig.2 Comparison of proliferation activity of HSC-LX2 cell in each group after treatment of 48h

圖3 作用72h后各組HSC-LX2細(xì)胞增殖活性比較Fig.3 Comparison of proliferation activity of HSC-LX2 cells in each group after treatment of 72h

圖4 熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)ROS含量Fig.4 Fluorescence confocal microscopy to detect ROS content in HSC-LX2 cell

2.3 各組HSC-LX2細(xì)胞PKC、Pyk2、SRC蛋白表達(dá)比較 與空白血清組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組PKC 表達(dá)減低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）；與 AngⅡ組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組PKC表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白血清組比較，鱉甲煎丸中、低劑量組 Pyk2 的表達(dá)減低（P＜0.01，P＜0.001）；與 AngⅡ組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組Pyk2的表達(dá)明顯減低（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001）。與空白血清組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組SRC表達(dá)明顯減低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01）；與 AngⅡ組比較，鱉甲煎丸高、中劑量組SRC表達(dá)減低（P＜0.05，P＜0.05）。見(jiàn)圖 5。

圖5 各組HSC-LX2細(xì)胞PKC、Pyk2、SRC蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of protein expression of PKC,Pyk2 and SRC in each group

3 討論

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)成分異常沉積，并影響肝臟的功能，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，其病因大致可分為感染性、先天性代謝缺陷、化學(xué)毒物性、自身免疫性肝病等。目前認(rèn)為，HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，抑制HSC的激活和轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是抗纖維化研究的熱點(diǎn)。對(duì)慢性肝臟疾病動(dòng)物模型的研究已證實(shí)了疾病發(fā)展過(guò)程中存在著氧化應(yīng)激作用。還有研究證實(shí)，AngⅡ在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，可促進(jìn)肝纖維化的形成[12]。

為了探索AngⅡ?qū)SC-LX2細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響，筆者采用AngⅡ刺激HSC-LX2細(xì)胞，通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組ROS產(chǎn)生明顯增多，經(jīng)鱉甲煎丸高、中劑量組含藥血清干預(yù)后，ROS均不同程度減少。這提示AngⅡ可以誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞產(chǎn)生ROS，鱉甲煎丸對(duì)此具抑制作用。

為了觀察鱉甲煎丸對(duì)HSC-LX2細(xì)胞增殖活性的影響是否存在時(shí)效、量效關(guān)系，筆者選用不同濃度（5%、10%、15%、20%）的高、中、低劑量鱉甲煎丸含藥血清，分別干預(yù)HSC-LX2細(xì)胞24、48、72h，用MTT法觀察細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，與AngⅡ組比較，5%鱉甲煎丸含藥血清培養(yǎng)24h后，高、中劑量組顯著抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖；48h后，高、中、低劑量組均能顯著抑制HSC-LX2細(xì)胞增殖；72h后，中劑量組有顯著抑制效果。此外，除了15%中劑量鱉甲煎丸含藥血清培養(yǎng)48h后有顯著抑制效果，其余各組、各時(shí)間段均無(wú)顯著抑制作用。由此可見(jiàn)，5%含藥血清干預(yù)48h的增殖抑制作用最明顯，各劑量組之間沒(méi)有呈現(xiàn)出量效關(guān)系。究其原因主要有以下兩方面：一方面含藥血清制備尚無(wú)統(tǒng)一的給藥方案[13]，本研究采用不同劑量鱉甲煎丸連續(xù)灌胃7d，2次/d的方法，然后取血制備含藥血清。經(jīng)過(guò)大鼠機(jī)體的代謝，各劑量組血藥濃度是否仍有明顯差異，尚不確定。另一方面培養(yǎng)液中含藥血清的濃度過(guò)高有可能反而降低細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。從本研究的結(jié)果看，5%的含藥血清濃度較為適宜。

AngⅡ能夠刺激HSC-LX2細(xì)胞產(chǎn)生ROS并增殖，涉及的環(huán)節(jié)錯(cuò)綜復(fù)雜。PKC、Pyk2和SRC很可能也參與其中。PKC屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛存在于機(jī)體的組織細(xì)胞內(nèi)，它被多種因素激活后，可通過(guò)磷酸化下游蛋白、激活蛋白激酶和誘導(dǎo)幾種核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的OS反應(yīng)[3-5]。Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ組中胎牛血清對(duì)PKC表達(dá)的抑制較明顯，空白血清組的PKC表達(dá)明顯增強(qiáng)。經(jīng)鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)后，PKC的表達(dá)同樣受到抑制。結(jié)合ROS及MTT的結(jié)果可知，PKC參與了AngⅡ-ROS誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞增殖過(guò)程，鱉甲煎丸可抑制PKC的表達(dá)。

Pyk2是粘著斑激酶FAK家族重要成員之一，參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JAK/STAT、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）等多條信號(hào)通路的傳遞，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和黏附等生理過(guò)程。在AngⅡ的刺激下，Pyk2是多種細(xì)胞信號(hào)途徑的一種上游調(diào)節(jié)因子，參與了AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞蛋白合成，有望成為心臟間質(zhì)纖維化防治的新靶點(diǎn)[14-15]。本研究結(jié)果提示，與空白血清組比較，AngⅡ組Pyk2表達(dá)增強(qiáng)，經(jīng)鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)后，Pyk2蛋白表達(dá)受到抑制。結(jié)合ROS及MTT的結(jié)果，筆者認(rèn)為Pyk2也參與了AngⅡ-ROS誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞增殖過(guò)程，可以將其作為防治肝纖維化的潛在靶點(diǎn)，而鱉甲煎丸對(duì)其表達(dá)具有抑制作用。

SRC被認(rèn)為是AngⅡ調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號(hào)的關(guān)鍵成員。在血管平滑肌細(xì)胞中SRC以ROS依賴的方式被G蛋白激活，并調(diào)節(jié)諸如Pyk2、JAK/STAT等下游信號(hào)。在AngⅡ作用下，Pyk2和SRC、PI3K等共同導(dǎo)致了細(xì)胞生長(zhǎng)及局部黏附。ROS能夠以直接或間接的方式激活SRC，SRC反過(guò)來(lái)通過(guò)一系列的信號(hào)通路對(duì)ROS具有調(diào)節(jié)作用，許多研究已經(jīng)表明SRC能夠呈正反饋地促進(jìn)ROS的生成[16-17]。本研究結(jié)果提示，與AngⅡ組比較，SRC對(duì)空白血清組中的大鼠血清更敏感，而鱉甲煎丸含藥血清對(duì)SRC表達(dá)有顯著的抑制作用。結(jié)合ROS及MTT的結(jié)果，筆者認(rèn)為SRC是AngⅡ-ROS誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞增殖的促進(jìn)因素，而鱉甲煎丸可抑制其表達(dá)。

綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者得出以下結(jié)論：AngⅡ可以誘導(dǎo)HSC-LX2細(xì)胞產(chǎn)生ROS，繼而影響PKC、Pyk2、SRC蛋白的表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖。鱉甲煎丸可通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生，下調(diào)PKC、Pyk2、SRC蛋白的表達(dá)，從而抑制HSC-LX2細(xì)胞的增殖。PKC、Pyk2、SRC諸蛋白在其中的調(diào)控機(jī)制，將在后續(xù)研究中采用siRNA技術(shù)予以探討。