趙一蔚，任培樂，于鳳旭，代紅燕，聶永梅

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，新疆烏魯木齊830011；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心臟大血管外科，四川瀘州646000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830011

前言

血管內(nèi)皮細(xì)胞處于血管內(nèi)腔面，是血流與血管壁相互作用的界面，對(duì)機(jī)械刺激、炎癥信號(hào)以及血液循環(huán)中激素水平的變化敏感［1］。正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的前提條件，其功能異常是心血管疾病早期的重要特征，與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓及心衰等疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［2］。在機(jī)械刺激中剪切應(yīng)力作為主要的力學(xué)刺激，不僅影響內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能，還可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中基因的表達(dá)［3］。當(dāng)剪切應(yīng)力≥15 dyne/cm2時(shí)，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中血管舒張因子、生長抑制因子和抗氧化劑等的表達(dá)，同時(shí)可以抑制血管收縮因子、生長因子、炎癥介質(zhì)等的表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞不易受損。而低剪切應(yīng)力（±4 dyne/cm2）時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)呈多角形，排列不規(guī)則，易受化學(xué)物質(zhì)的刺激，分泌血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等血管活性物質(zhì)、炎癥介質(zhì)、生長因子、粘附分子，使內(nèi)皮細(xì)胞損傷；促進(jìn)細(xì)胞增生、細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，具有促動(dòng)脈粥樣硬化的作用［4-5］。

研究發(fā)現(xiàn)Piezo1是一種機(jī)械敏感性陽離子通道［6］。該通道表現(xiàn)出參與細(xì)胞發(fā)育、血管容量調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移，以及細(xì)胞增殖和延長等生物學(xué)作用，在血管發(fā)育形成過程中也有重要參與，目前受到科學(xué)家們的關(guān)注［7］。已證實(shí)在發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化過程中，內(nèi)皮細(xì)胞受到顯著損害；剪切應(yīng)力作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞中機(jī)械離子通道Piezo1有表達(dá)，那么在受到不同強(qiáng)度剪切應(yīng)力刺激時(shí)，Piezo1的生成與表達(dá)會(huì)有何種變化，尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過加載不同強(qiáng)度剪切應(yīng)力，從基因和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)Piezo1表達(dá)情況，研究流體剪切應(yīng)力強(qiáng)度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中Piezo1表達(dá)的影響，進(jìn)而了解流體剪切應(yīng)力強(qiáng)度是否可以影響Piezo1的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

M199培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰酶、雙抗青/鏈霉素合劑（Hyclone,美國），胎牛血清（Gibco,美國），人纖維黏連蛋白（CORNING,美國），TRIzoL總RNA提取試劑（Thermo Fisher Scientific,美國），PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific, 美國），QuantiFast SYBER Greeen PCR Kit（QIAGEN, 美國），Piezo1 引物、β-actin 引物（生工生物,中國上海），RIPA 裂解液（Thermo Fisher Scientific，美國），PMSF（博士德生物, 中國武漢），蛋白酶抑制劑（Thermo Fisher Scientific,美國），BCA 法蛋白定量試劑盒（Pierce,美國），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Solarbio,中國），4×蛋白上樣緩沖液（Solarbio, 中國），預(yù)染蛋白分子量Marker（Thermo Fsher Scientific,美國），GAPDH 兔抗多克隆抗體（GOODHERE,中國），兔源抗Piezo1多克隆抗體（Abcam,美國），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔（中杉金橋, 中國北京），SuperSignal West Femto 高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物（Thermo Fisher Scientific,美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

EA.hy926 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（來自上海細(xì)胞庫）進(jìn)行常規(guī)體外培養(yǎng)，于含10%胎牛血清、1%雙抗的M199 完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 剪切應(yīng)力加載

將已經(jīng)過消毒處理的載玻片（75 mm×25 mm），放入10 cm 培養(yǎng)皿中。將1 mL 纖維黏連蛋白（Fibronectin, FN）鋪于載玻片上，再將培養(yǎng)皿移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置30 min，回收FN。將消化后的細(xì)胞1 mL（1×106個(gè)/mL）均勻種植于載玻片上。將培養(yǎng)皿輕輕放至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加10 mL M199 生長液到培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長滿后，將載玻片放置于平行板流槽中，分別加載不同強(qiáng)度剪切應(yīng)力（根據(jù)裝置低中高檔各設(shè)置兩組，對(duì)應(yīng)應(yīng)力依次為0、2.37、4.14、7.11、9.47、14.21、17.76 dyne/cm2）處理2 h。

平行板流室系統(tǒng)是由四川大學(xué)設(shè)計(jì)，提供相關(guān)標(biāo)測(cè)數(shù)據(jù)，成都西木子公司制造。安裝后流室的尺寸為：長185 mm，寬95 mm，高0.8 mm。流入孔與流出孔之間的距離為215 mm。實(shí)驗(yàn)裝置包括恒流泵、流通管、流室、灌流瓶（圖1）。用無血清M199培養(yǎng)液作為灌流液體，其粘度為0.72 mPa·s。力學(xué)加載過程中儲(chǔ)液瓶始終置水浴鍋中保持37 ℃，培養(yǎng)液中維持pH 值為7.0，為排除流體靜水壓的影響，整個(gè)裝置系統(tǒng)應(yīng)處在同一個(gè)水平面上。

圖1 流室系統(tǒng)簡圖Fig.1 Schematic diagram of flow chamber system

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集細(xì)胞，1 000 r/min 離心棄上清，加入1 mL TRizol 試劑混勻。將勻漿樣品在室溫放置5 min，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min，取上清。加入0.2 mL氯仿，4 ℃、13 000 r/min 離心10～15 min，取出水相RNA（約500 μL），加入等體積異丙醇。4 ℃、13 000 r/min離心10 min，去上清，加入30 μL75%乙醇（Rnase-Free ddH2O 配置）洗滌沉淀。用NANODROP 2000 Spectrophotometer核酸定量儀對(duì)提出的RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。采用Thermo RevertAid?第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具體操作根據(jù)Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）說明書進(jìn)行。引物序列：Piezo1，F(xiàn)：5'-gcagccgagagaaagagaag-3'，R：5'-agagcagtgggaaccagatg-3'；β- actin，F(xiàn)：5'- ggtagtcaccaaggcattcatt- 3'，R：5'-ctccttaatgtcacgcacgat-3'。配置20 μL體系，按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50 ℃2 min；95 ℃10 min；95 ℃15 s；60 ℃30 s；72 ℃30 s ；40 個(gè)循環(huán)后延伸20 s。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析。

1.5 Western-blot

自平行板流槽取出玻片，用遇冷的PBS液洗2次，并吸出；加入1 mL PBS刮下細(xì)胞，移入1.5 mL無菌的EP管中，高速離心3～5 min，吸出PBS。在EP管中按比例加入蛋白裂解液，冰上孵育30 min，期間漩渦振蕩3～4次。之后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，將上清轉(zhuǎn)移到無菌EP管。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白樣品濃度。蛋白變性。SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳，80 mA恒流，4 ℃過夜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉6 h，加入一抗（1:1 000），4 ℃孵育過夜。取出常溫放置30 min，洗滌3 次，每次10 min。加二抗（1:1 000），搖床振蕩，室溫避光孵育2 h。吸出二抗。蒸餾水洗滌1次，5 min。1:1配置顯色液，將顯色液敷于PVDF上約3 min，使用Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像儀中拍照。蛋白分子質(zhì)量：Piezo1為286 kD；GAPDH為37 kD。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 剪切應(yīng)力強(qiáng)度影響EA.hy926中Piezo1的基因表達(dá)

加載不同強(qiáng)度剪切應(yīng)力，處理細(xì)胞，qRT-PCR 方法檢測(cè)Piezo1 mRNA 表達(dá)情況，使用2-ΔΔCT進(jìn)行結(jié)果分析。對(duì)照組與處理組相比，只有在刺激強(qiáng)度為4.14 dyne/cm2時(shí)，Piezo1 mRNA 的表達(dá)顯著降低（圖2），與靜止?fàn)顟B(tài)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。其他處理組與對(duì)照組比較均無差異。

圖2 不同強(qiáng)度剪切應(yīng)力對(duì)Piezo1 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of shear stress of different intensities on the expression of Piezo1 mRNA

2.2 剪切應(yīng)力強(qiáng)度影響EA.hy926 中Piezo1 的蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，Western-blot 方法進(jìn)行蛋白測(cè)定。通過Image pro plus6.0 對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，定量分析發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)與基因表達(dá)結(jié)果相一致。在刺激強(qiáng)度為4.14 dyne/cm2時(shí)，Piezo1 蛋白表達(dá)量最低（圖3），與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。其余處理組與對(duì)照組比較均無差異。

圖3 不同強(qiáng)度剪切應(yīng)力對(duì)Piezo1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of shear stress of different intensities on the expression of Piezo1 protein

2.3 低剪切應(yīng)力刺激影響EA.hy926細(xì)胞形態(tài)

靜止?fàn)顟B(tài)細(xì)胞呈長梭形（圖4a）。低剪切應(yīng)力（4.14 dyne/cm2）刺激后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，局部可見細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞有脫落現(xiàn)象（圖4b）。

3 討論

3.1 剪切應(yīng)力影響內(nèi)皮細(xì)胞中Piezo1的表達(dá)

圖4 光學(xué)顯微鏡下EA.hy926細(xì)胞株形態(tài)Fig.4 Morphology of EA.hy926 cell lines under optical microscope

血流動(dòng)力學(xué)作為一個(gè)重要因素，參與血管的生理和病理調(diào)節(jié)活動(dòng)。內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)受到血管的力學(xué)作用，其中剪切應(yīng)力（是血流經(jīng)過血管時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞受到的與血管壁平行的力）為主要的力學(xué)刺激因素之一。內(nèi)皮細(xì)胞在不同區(qū)域的血管中，受到的剪切應(yīng)力也不盡相同。動(dòng)脈粥樣硬化的好發(fā)部位，如動(dòng)脈分叉處和血管彎曲處等為±4 dyne/cm2。正?；蛏愿叩募羟袘?yīng)力（≥10～15 dyne/cm2）可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎作用［8］。有研究顯示在剪切應(yīng)力作用下Piezo1 作為力學(xué)感受器在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)參與到剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的Ca 的流動(dòng)以及細(xì)胞遷移［9-10］。Piezo1蛋白參與細(xì)胞發(fā)育、血管容量調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移，以及細(xì)胞增殖和延長等作用［11］。那么Piezo1 是否在人內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)？剪切應(yīng)力是否也會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞中Piezo1的表達(dá)？基于此，本研究選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926 作為研究對(duì)象［12］，分別設(shè)置不同強(qiáng)度力刺激內(nèi)皮細(xì)胞。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在靜止?fàn)顟B(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中有Piezo1表達(dá)；通過不同強(qiáng)度力學(xué)刺激，觀察到強(qiáng)度刺激在4.14 dyne/cm2時(shí)Piezo1變化最明顯，其基因與蛋白表達(dá)均顯著降低；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Piezo1表達(dá)與剪切應(yīng)力的強(qiáng)度梯度無相關(guān)性，Piezo1對(duì)強(qiáng)度為4.14 dyne/cm2最為敏感。原因分析可能需要選擇不同的力作用時(shí)間來檢測(cè)其生物特性。

3.2 剪切應(yīng)力影響內(nèi)皮細(xì)胞中Piezo1 表達(dá)的臨床意義

2010年Coste等［6］研究發(fā)現(xiàn)Piezo1是機(jī)械敏感陽離子通道，由Piezo1/FAM38A基因編碼，由包含了30個(gè)跨膜區(qū)域約2 500個(gè)氨基酸構(gòu)成，參與多種生理學(xué)過程。類似于許多對(duì)機(jī)械敏感的內(nèi)生性陽離子通道，通過GsMTx4可以抑制Piezo1的活性［13］。Miyamoto等［14］發(fā)現(xiàn)膀胱上皮中Piezo1缺失時(shí)的應(yīng)力誘導(dǎo)會(huì)引起Ca流動(dòng)減少，以及ATP釋放減少。Piezo1在皮膚、膀胱、腎、肝、內(nèi)皮細(xì)胞、牙周組織細(xì)胞及紅細(xì)胞中有廣泛表達(dá)［15］。Li等［16］研究顯示Piezo1在小鼠發(fā)育血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，Piezo1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育的致命性損傷，在妊娠中期造成血管重構(gòu)缺陷。Piezo1是血管發(fā)育的重要因素，體外層流剪切應(yīng)力作用下內(nèi)皮細(xì)胞中Piezo1缺失，表現(xiàn)出細(xì)胞排列缺陷，這些提示Piezo1的機(jī)械力傳導(dǎo)與細(xì)胞的形態(tài)學(xué)調(diào)節(jié)有關(guān)［9］。靜止?fàn)顟B(tài)下，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺少Piezo1時(shí)，表現(xiàn)為eNOS蛋白總量減少，血管內(nèi)皮生長因子誘發(fā)的Ser-1177（增強(qiáng)eNOS活動(dòng)的關(guān)鍵因子）的磷酸化水平降低，以及內(nèi)皮細(xì)胞遷移受到抑制［11］。Huang等［17］通過研究發(fā)現(xiàn)MiR-103a在急性心?；颊咧忻黠@升高，而這一過程可能是通過調(diào)節(jié)Piezo1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。Piezo1的結(jié)構(gòu)和功能影響高血壓的發(fā)生過程［18］。運(yùn)動(dòng)過程中血流可以影響Piezo1這一機(jī)械通道，最終引起血管的收縮過程［19］。本課題組前期研究明確動(dòng)脈粥樣硬化好發(fā)部位的流體剪切應(yīng)力在4 dyne/cm2左右［20］。4 dyne/cm2強(qiáng)度比10 dyne/cm2強(qiáng)度明顯刺激內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1蛋白增高［21］。低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)IL-8表達(dá)，且4.2 dyne/cm2時(shí)的蛋白量最高［22］。Fractalkine在動(dòng)脈粥樣硬化中也起重要作用，而低剪切應(yīng)力可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞Fractalkine表達(dá)上調(diào)，這一過程有低剪切應(yīng)力激活的p38信號(hào)分子參與［23］。本實(shí)驗(yàn)顯示低剪切應(yīng)力4.14 dyne/cm2可以明顯降低Piezo1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，提示Piezo1可能參與低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化過程。

本研究通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度的力學(xué)刺激，發(fā)現(xiàn)低剪切應(yīng)力4.14 dyne/cm2降低Piezo1在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，這為了解復(fù)雜的生命發(fā)育過程提供了新方式和觀點(diǎn)。然而剪切應(yīng)力是如何刺激Piezo1 表達(dá)，Piezo1又是否以及如何參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，還需要進(jìn)一步深入研究。